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标题: 光照条件和共培养时间对大豆的遗传转化效率影响 [打印本页]

作者: admin 时间: 2017-8-28 09:31
标题: 光照条件和共培养时间对大豆的遗传转化效率影响
　1 试验材料的培育
　　田间设计采随机完全区集设计（RCBD），三重复，每小区种植两行，行长5m，行株距40×10 cm。栽培管理按一般惯行方法为之，并于植株成熟收获时，每小区逢机取样10 株，作化学组成分及异黄酮分析。
　　2 试验方法
　　2.1 水分
　　铝皿预先洗净，于 105℃加热干燥，烘干后放入恒温箱中至恒温后（约30 分钟）记录秤重。样品秤1g，放入铝皿，在100℃的条件下烘干约两天。
　　2.2 灰分
　　将坩埚浸泡于足量的 10%稀盐酸溶液，加热煮2 小时以蒸馏水洗净，干燥；再将坩埚放入灰化炉中，以600℃以上的温度强热4小时在灰化炉中稍放冷后，移至恒温箱中，恒温后秤其重量，记录之。
　　2.3 共培养
　　以共培养基pH值5.4、在黑暗和24℃条件下培养3d为基本的共培养条件。本研究在共培养阶段分别设计3个单因素试验：①共培养基pH值试验：设置4种共培养基pH值处理：pH值分别为5.4、6.0、6.6、7.2；②共培养时间试验：设置4个处理：共培养时间分别为3、7、10、14d；③共培养阶段光照试验：以24小时为周期设置4个不同长度光照时间处理：0、10、16、24 h·d-1，光照强度为3000～4000LX。每个试验重复3次，每个处理接种子叶节外植体100个。
　　2.4 统计分析
　　2.4.1 多变量变方分析。本试验的数据经由 SPSS进行多变量变方分析，计算分析其平均值、标准偏差，并估算表现型变异系数（PCV）及遗传型变异系数（GCV）。
　　2.4.2 遗传率及相关系数估算。各性状的广义遗传率与性状间表现型及遗传型相关系数依下列各式估算，并以SAS 的CORR Procedure 进行表现型相关系数的显著性测验。
　　3 结果
　　共培养光照条件对转化率的影响以品种A为材料，进行了共培养光照长度的试验，结果显示共培养阶段光照影响大豆子叶节的转化效率。12h·d-1光照（5.04%）和 16h·d-1光照（5.25%）显著高于0h·d-1光照（1.61%）和 24h·d-1光照（0.45%）（p <0. 01）；而 12 h·d-1光照和 16h·d-1光照差异不显著（P>0.05），0 h·d-1光照和 24h·d-1光照差异不显著（P>0.05）。12 h·d-1光照和 16h·d-1光照条件下大豆子叶，在共培养阶段变绿，表现出更强的生命力，获得最高的转化率；而 0 h·d-1光照的子叶节与共培养前无明显变化，为黄绿色，只有经过转入诱导培养（光照条件下）2～3d 后的才能变成绿色；在 24h·d-1光照下子叶节变得深绿色，子叶周围农杆菌较少。由本研究结果说明 12～16 h·d-1光照条件是大豆子叶节共培养的适宜光照条件，可显着提高大豆子叶节的转化率。
　　4 讨论
　　某一性状的遗传率通常指其遗传变方与总变方或表现型变方的比值，以h2表示之。估计遗传率有助于了解该性状在杂交后代选拔的难易，以及预知选拔进展情形。大豆为一种对环境反应非常敏感的作物，其品种与期作间具显著的交感作用。大豆子实产量、蛋白质及含油量等遗传率的研究，结果也显示子实产量及蛋白质产量的遗传率低，但蛋白质含量及含油量的遗传率高。性状间的相关关系，一般为表示两性状间的个别关系，通过相关分析可以了解性状间相互影响的程度。作物育种时常以两种以上具有经济价值的性状作为改良作物的选拔指标。因此，在性状间相关的大小十分重要，而大豆表现型相关亦因栽培季节不同，而有相当大的差异。从杂交后代中逢机选出不同蛋白质与油分含量的种子，进而分析种子蛋白质、油分、寡糖及含硫胺基酸间的相关关系，结果显示蛋白质与种子产量呈显著负相关；油分和种子产量呈显著正相关；蛋白质与油分呈显著负相关；总醣、植物蜜糖（raffinose）+菜豆糖（stachyose）与蔗糖均与蛋白质呈显著负相关；含硫胺基酸（sulfur-containing amino acids）与蛋白质呈显著正相关。
　　农杆菌的生长状态和菌液浓度。一般来说，利用对数生长期的农杆菌进行菌种的保存、筛选、繁殖和转化效果最好。用于感染外植体的农杆菌，也最好是处于对数生长期的。农杆菌培养一般用LB、YEP、YEB、MinA等培养基。在农杆菌快速生长的过程中，常出现质粒丢失或基因突变，因此对保存的菌种要定期检查。外植体的预培养和感染时间。外植体的预培养是指在用农杆菌感染前，将外植体放在含有激素的培养基上培养一段时间，目的是刺激外植体细胞进行分化细胞分裂，处于分裂状态的细胞易于接受外源DNA，使转化率提高，但也有报道称外植体经预培养后转化效率反而下降的。因此是否需要预培养不能一概而论。农杆菌感染外植体。共培养结束后，就可以将农杆菌接种到外植体的损伤切面。具体方法一般是将切割成小块的外植体浸泡在制备好的农杆菌工程菌液中，浸泡一定时间后，吸去菌液以及外植体表面的菌液，即开始共培养。要注意农杆菌感染外植体的时间不宜太长，如果浸泡时间太长，会因农杆菌毒害缺氧而软腐，故常采用低农杆菌OD值和较短的浸泡时间。总之，光照条件是共培养的重要因素，农杆菌生存在土壤中，黑暗是它的自然生存环境状态。共培养时黑暗条件有利于农杆菌的生长，而光照则有利于大豆子叶节分生细胞分裂及外植体健康生长。因此同时满足农杆菌和大豆子叶节分化的需要对转化很重要。
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