玉米泛素结合酶基因ZmUBC—76的功能

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　目前，在酵母（Saccharomyces cerevisiae）[4]、拟南芥[5]、水稻[6]和香蕉[7]等多种真核生物中都有关于E2蛋白的报道。对植物泛素结合酶功能的研究主要集中在DNA修复、生长发育和抗逆境胁迫响应等方面[8-9]。比如，在拟南芥中发现37个E2，这些E2蛋白在拟南芥的生长、发育及響应逆境胁迫中起到重要的作用[5]。其中AtUBC13参与拟南芥的表皮细胞分化及缺铁应激反应[10]。AtUBC1和AtUBC2参与到叶的发育、激活成花抑制基因和UV抗逆反应。atubc1-1和atubc2-1的功能丧失双突变体表现出莲座叶显著减少和早开花表型[11]。在水稻的39个E2蛋白中，14个OsUBCs在干旱或者盐胁迫下出现差异表达，几乎所有OsUBC基因的表达都受到IAA、6-BA、GA及ABA中至少2种激素的诱导[12]。在前期研究中，笔者从玉米基因组中发现75个E2家族基因中，其中35个基因在NaCl处理时呈上调表达，22个基因在PEG6000处理时上调表达，5个基因在4 ℃处理时上调表达[13]。同样，在怪柳、番茄和香蕉等其他作物中也有关于E2蛋白的类似报道[7， 14-15]。
玉米（Zea Mays L.）是当今世界重要的粮食作物之一，亦是重要的饲料和工业原料作物，在世界粮食总产量中处于第一位[16]。中国作为世界第二大玉米生产国，近30多年来，玉米生产发展非常迅速，总产量也呈逐年上升趋势。世界粮农组织统计数据库（FAOSTAT）显示在2012年，玉米产量超过稻谷产量，成为中国第一大粮食作物[17]。2013年，中国玉米常年种植面积达3 510万hm2，总产量约2.17亿t，占粮食总产量的1/3。但在实际生产中，玉米常常会因受到诸多不利环境因素的影响而大面积减产，比如干旱、盐胁迫和低温等。在本研究中，笔者利用生物信息学技术从玉米的基因组发现一个新E2家族基因，并将其命名为ZmUBC-76。ZmUBC-76含有泛素结合酶典型的催化结构域及高度保守的半胱氨酸残基。利用荧光定量PCR方法，笔者进一步对ZmUBC-76在玉米不同组织器官、旱、盐胁迫及低温胁迫的表达进行分析。从而分析该基因在植物生长发育和不同逆境下的作用，为挖掘玉米抗逆基因和丰富E2蛋白在不同作物中的功能研究提供一定的理论和试验依据。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 植物材料 玉米（Zea mays，B73）种子保存于南亚热带作物研究所。玉米组织器官根（root）、茎（stem）、叶（leaf）、穗（tassel）、幼果（young seed）和穗丝（silk）取自大田种植的玉米自交系B73植株，采样时期为乳熟期。逆境处理所用材料为B73种子萌发而来的幼苗，取样部位为叶片。实验设3次重复，所有取样剪成2 cm左右的小段，立即放入液氮速冻并转入-80 ℃冰箱中保存、备用。
　　1.1.2 主要试剂 植物RNA提取试剂盒购自北京华越洋生物公司（Huayueyang Bio Co.， Ltd， Beijing， China）；反转录试剂及Realtime PCR试剂盒购自宝生物工程有限公司（TaKaRa Bio， Inc.， Kusatsu， Japan）；引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成；其他试剂购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
　　1.2 方法
　　1.2.1 ZmUBC-76序列的获得及生物信息学分析
　　利用酵母和拟南芥UBC蛋白序列在玉米基因组数据库（MaizeGDB，http：//www.maizegdb.org/）和Phytozome（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/plaza/versions/plaza/）中进行BLASTP搜索。其ORF、氨基酸长度和染色体定位信息由Phytozome数据库获得。应用在线软件SMART（http：//smart.emblheidelberg.de/）和Plant-mPLoc（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/cgibin/PlantmPLoc.cgi）分析蛋白的结构域和亚细胞定位，蛋白的等电点和分子量用ExPASy（http：//expasy.org/tools/）进行分析，ZmUBC-76基因的外显子内含子结构利用Gene Structure Display Server（GSDS）（http：//gsds.cbi.pku.edu. cn/）在线软件分析。利用MEGA 5软件进行氨基酸序列同源性分析及系统发育分析，构建Neighbor-Joining进化树，1 000次重复，其他均为默认设置。
　　1.2.2 组织器官表达模式分析 Trizol法提取玉米根、茎、叶、穗、幼果和穗丝的总RNA，经DNAaseⅠ消化后反转录合成第一链cDNA后作为模板，具体操作步骤参照说明书。根据ZmUBC-76基因全长设计荧光定量引物ZmE2-76F（5′-AGGGCTTACAT
　　GTCTGGGAC-3′）和ZmE2-76R（5′-TTTCCAGCTC
　　CATCACTCGT-3′），并以玉米actin基因为内参基因，引物为ZmA-F（5′-TCACTACGACTGCCGAGC
　　GAG-3′）和ZmA-R（5′-GAGCCACCACTGAGGAC AACATTAC-3′）。荧光定量PCR反应所用仪器为Roche的LightCycler480，荧光定量PCR酶为TaKaRa公司的SYBR Green Master Mix。反应体系为20 mL，其中模板cDNA 40 ng，上、下游引物各250 nmol/L，SYBR Green Master Mix 10 μL，其余用ddH2O补齐。反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 10 s，59 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，40 个循环后作熔解曲线（95→65 ℃，0.1 ℃·s-1）。利用2-ΔΔCt计算基因的相对表达量。所有样品进行3次重复，均设阴性对照。在分析ZmUBC-76基因的表达时，上调或者下调大于2倍时才认为存在差异。所有试验3次重复。
　　1.2.3 ZmUBC-76基因的逆境表达分析 逆境试验所用材料为B73种子萌发而来的幼苗。种子萌发后，转入1/2 Hoagland培养液，在培养箱中继续培养，生长条件为（28 ± 2） °C，14 h光照，10 h黑暗。3周后，选择长势均一的幼苗进行下步试验。低温胁迫处理组：将长势一致、生长健壮的玉米幼苗放在4 ℃培养箱中培养，取样时间点为0、1、6、24 h。盐胁迫处理组：在200 mmol/L NaCl的培养液中培养幼苗，取样时间点为0、1、6、24 h。干旱胁迫处理组：将长势均一、生长健壮的3周苗龄玉米幼苗转入含20% PEG6000的培养液中培养，取样时间点同样为0、1、6、24 h。未处理的幼苗作为对照，采样时间点与处理组一致。取样部位为葉片。每个时间点4株苗混合采样，所有试验3次重复。荧光定量PCR方法如上。
　　2 结果与分析
2.1 ZmUBC-76基因生物信息学分析
　　利用酵母和拟南芥UBC蛋白序列在MaizeGDB和Phytozome进行BLASTP搜索，获得1条泛素结合酶家族基因序列，其在MaizeGDB及Phytozome数据库中的登录号分别为ZM04G21350和GRM ZM2G003953，根据已经发表的玉米E2家族基因的编号，将其命名为ZmUBC-76。该基因序列开放阅读框为2 589 bp，编码的蛋白具有862个氨基酸，其分子量为98.91 ku，理论等电点为8.07，位于玉米第4号染色体，位置为Chr4：156，543，382 - 156，548，976。ZmUBC-76基因有13个内含子。预测该蛋白定位于细胞核。ZmUBC-76蛋白有泛素结合酶活性位点的保守序列及半胱氨酸残基，含有UBC结构域和1个C端延长的蛋白序列，属于Class Ⅱ家族E2蛋白（图 1）。
　　进一步分析ZmUBC-76蛋白与其他植物UBC蛋白的亲缘关系，对13个酵母、37个拟南芥E2及ZmUBC-76蛋白序列进行多重序列对比，并利用MEGA 5软件构建进化树。进化分析表明，ZmUBC-76属于UBC15 group，与拟南芥的AtUBC24、AtUBC25及AtUBC26聚到同一分支，具有较高同源性（图2）。
　　2.2 ZmUBC-76在玉米组织器官中的表达模式
　　为研究该基因的组织器官表达特异性，对玉米根（root）、茎（stem）、叶（leaf）、穗（tassel）、幼果（young seed）和穗丝（silk）6个组织器官进行qRT-PCR分析。结果表明，该基因在各组织中均有表达，但在穗丝中的表达量最低，在幼果中的表达量最高，根中的表达量次之，大概都是穗丝中表达量的6倍左右。在茎、叶、穗中的表达呈逐步上升趋势，分别是穗丝中表达量的2、3、4倍左右，表达强弱依次为幼果>根>穗>叶>茎>穗丝（图3）。
　　2.3 ZmUBC-76在不同胁迫处理下的表达模式
　　从图4可以看出，4 ℃处理1、6、24 h后，ZmUBC-76的表达量相对于0 h时的变化都小于2倍，可以认为没有显著性变化，即在处理时间内ZmUBC-76对低温没有响应。然而在NaCl处理组，ZmUBC-76的表达量在处理1、6、24 h后分别下降为0 h的0.56、0.47和0.25倍，呈逐渐下调趋势。同样的在PEG6000处理组，在检测时间内ZmUBC-76的表达量也是逐步下调，且趋势与NaCl处理组相似，处理1、6、24 h后分别下降为0 h的0.53、0.42和0.21倍。
　　3 讨论
　　植物是固着生长的生物，在其生长过程中经常会受到干旱、盐碱、高温、低温等非生物胁迫的影响[18]。这些非生物胁迫会导致植物水分亏缺，产生渗透胁迫，影响植物的生长发育，甚至导致植物死亡。在实际生产中，这些不良的生长环境条件往往会造成农作物的大量减产或绝收，如我国有60%的玉米种植面积受到干旱胁迫，每年因旱灾而减产20%～30%[19]。当然，植物在长期进化过程中也形成了一系列机制以适应和抵御各种逆境胁迫。在这其中，泛素-蛋白酶体途径在植物生长发育和逆境胁迫响应中的作用已得到广泛认可[2]。泛素结合酶（E2）是泛素-蛋白酶体途径的重要组成部分，对泛素化修饰的特异性和精确时空性起关键作用[4]。研究E2在植物响应逆境胁迫中的作用具有重要的理论和实际意义。
　　对基因的组织器官表达模式分析有助于解析其在生物体中功能。在笔者的研究中，ZmUBC-76在各组织器官中均有表达，在穗丝中的表达量最低，在幼果中的表达量最高，根中的表达量次之，大概都是穗丝中表达量的6倍左右。在茎、叶、穗中的表达呈逐步上升趋势，分别是穗丝中表达量的2、3、4倍左右。同样在其他作物的组织器官中，E2基因也表现不同表达模式。如在香蕉中MaUBC10/11/33/34/61在所有的組织器官中都表达，在根、茎和叶中表达量最高，MaUBC6/11/34/35/45/61在茎中表达量最高，而MaUBC13/18/29/33/34/36/43/46/48/53/67/70在根中表达量最高[7]。在玉米的75个E2中，ZmUBC-29/31/45/53/60/75在幼果中高表达[13]。在水稻中OsUBC13/32/33/34在叶中表达量最高[12]。该结果表明，ZmUBC-76在玉米的生长发育中具有重要的作用，特别是根和幼果的发育。
　　目前有不少关于植物E2参与植物生长发育和逆境胁迫响应的报道。如野生水稻的OgUBC1基因参与细胞内生物和非生物胁迫响应[21]。在盐和干旱胁迫下，3个水稻E2基因（OsUBC2/5/18）和5个拟南芥E2基因（AtUBC13/17/20/26/31）显著下调表达，只有3个水稻E2基因（OsUBC13/15/45）显著上调表达[12]。在玉米的75个E2家族基因中，35个基因在NaCl处理时呈上调表达，22个基因在PEG6000处理时上调表达，5个基因在4 ℃处理时上调表达[13]。香蕉的74个E2基因中，有45个和33个基因分别受到干旱胁迫及盐胁迫处理的诱导表达[7]。王安邦等的研究表明，香蕉的UBCE2在干旱胁迫下表达量最高；对盐胁迫响应不明显；低温胁迫时，在温度为15、10 ℃时MaUCE2的表达量上升不明显，而温度降到7 ℃和5 ℃时该基因的表达量迅速上升，在5 ℃时达到最大，为对照的4.08倍[20]。在拟南芥中过表达绿豆（Vigna radiata）的VrUBC1基因，植株在萌发过程中表现出对ABA和渗透胁迫的高度敏感反应，增强了ABA或盐诱导的气孔关闭，进而增强了植株对干旱胁迫的耐受性[21]。异源表达马铃薯泛素结合酶GmUBC2也能明显提高拟南芥的耐盐性[22]。与这些报道类似，在本研究中，笔者对ZmUBC-76基因在干旱、盐胁迫和低温下的表达进行了分析。结果显示在盐胁迫和干旱胁迫下，ZmUBC-76的表达呈逐渐下降趋势，在处理24 h时达到最低，分别是对照的0.25和0.21倍。在低温胁迫时，ZmUBC-76的表达量未出现显著变化。这些结果表明ZmUBC-76可能在植物响应盐胁迫和干旱胁迫时，起到负调控作用，即与胁迫发生时细胞内异常蛋白的增加呈负相关。但关于ZmUBC-76的互作蛋白及调控网络还需要进一步的研究。
目前，關于玉米泛素结合酶的研究报道还较少，本研究有助于丰富植物E2家族基因的研究，同时也能为玉米抗逆育种提供一些优异的基因资源。
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