超氧化物歧化酶基因的克隆及原核表达

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　短短芽胞杆菌[Brevibacillus brevis（Migula 1900）Shida et al. 1996]呈杆状，革兰氏阳性，产芽胞，不产生毒素，对环境安全友好[1-2]，在生物防治[3-6]、分泌表达外源蛋白[7-8]、微生物保鲜[9]、微生物降解[10-11]和工业生产[12]等方面应用广泛。目前，国内外学者已经对短短芽胞杆菌部分生防或代谢相关功能基因进行了研究，主要包括巯基-二硫化物氧化还原酶基因bdb[13]、α-乙酰乳酸脱羧酶基因ald[14]、耐碱性木聚糖酶基因xylB[15]、短杆菌酪肽生物合成相关基因tycA与tycB[16]、短短芽胞杆菌细胞壁基因[17]、dnaK基因[18]、编码3-己酮糖-6-磷酸合成酶和6-磷酸-3-己酮糖异构酶hps和phi基因[19]等。随着短短芽胞杆菌全基因组序列测序的完成，该菌株中与生防相关的功能基因正逐步被挖掘出来。
　　短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX为本课题组筛选得到的菌株，该菌株对不同植物和动物病原菌具有很好的抑制作用[19]，可促进植物生长[20]，对龙眼、枇杷等果实具有较好的保鲜效果[21-22]。基于该菌株全基因组序列测序的完成和数据分析[23]，本研究前期以其基因组DNA为模板，通过PCR擴增首次得到几丁质酶基因chiD序列，并进行了原核表达，获得的几丁质酶基因chiD序列片段为1 524 bp，编码507个氨基酸，理论蛋白质分子量约54.55 ku，其等电点在5.77左右，表明该几丁质酶为酸性几丁质酶[24]。
　超氧化物歧化酶（superoxiede dismutase，SOD）分为Mn-SOD、Fe-SOD和Cu/Zn-SOD等不同类型[25-26]，其中，Mn-SOD为诱导型表达，在应对环境变化或胁迫方面具有重要作用，尤其是在内生菌的定殖和生防方面，与抗病、促生作用相关[27]。目前，有关学者已经从蜡样芽胞杆菌[27]、枯草芽胞杆菌[28]、土壤环酸芽胞杆菌[29]等中克隆了Mn-SOD，并进行了原核表达，但国内外对短短芽胞杆菌Mn-SOD基因的研究较少。本研究以短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX为材料，利用PCR克隆超氧化物歧化酶基因，并在大肠杆菌中进行基因的原核表达，将有助于深入研究SOD在短短芽胞杆菌生防应用中的功能及探讨其对植物促长和生防的机理。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 菌株与载体 短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX和大肠杆菌DH5α为本实验保存；大肠杆菌BL-21（DE3）为福建省农业科学院植物保护研究所馈赠；载体pMD18-T购于Takara生物科技有限公司；pET-28a由福建省农业科学院土壤与肥料研究所馈赠。
　　1.1.2 主要试剂 限制性内切酶BamHⅠ与XhoⅠ购自Takara生物有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒购自BioTeke公司；dNTP购自北京天根生物有限公司；3 000 bp Marker购自Ferments生物有限公司；Mini Plasmid extraction kit购自OMEGA生物有限公司。LB液体培养基：1%胰蛋白胨，0.5%酵母浸粉，0.5% NaCl，添加1.7%琼脂为固体培养基；在LB固体培养基中添加40 μL 2% X-Gal、7 μL 20%异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）和50 μg/mL氨苄青霉素作为阳性克隆筛选培养基，添加50 μg/mL卡那霉素作为阳性转化子筛选培养基。
　　1.2 方法
　　1.2.1 引物设计与合成 根据短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX全基因组分析，获得超氧化物歧化酶开放阅读框，设计特异性扩增引物，在引物2端添加BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点，对SOD基因进行特异性扩增，用于SOD基因PCR扩增的上下游引物分别为SODORF_F（5′-CGCGGATCCATGGCACATCAA
　　CTTCCTGCATTGC-3′）和（SODORF_R 5′-CCGCTC
　　GAGTTACTTCGCTGCTGCGAAACGCTTGC-3′），委托上海博尚生物技术有限公司合成。
　　1.2.2 超氧化物歧化酶基因的克隆 以短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX总DNA为模板进行特异性PCR扩增。PCR反应体系为25 μL：模板DNA（20 ng/μL）1 μL，上下游引物各1 μL，dNTP混合液0.5 μL，Taq酶0.3 μL，Buffer 2.5 μL，ddH2O 18.7 μL。PCR反应程序：95 ℃变性5 min；接着94 ℃ 1 min，51 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35个循环；最后72 ℃ 10 min。用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，采用DNA凝胶回收试剂盒进行产物回收，与克隆载体pMD18-T连接，于16 ℃反应过夜；转化大肠杆菌DH5α感受態细胞，采用LB平板（添加40 μL 2% X-Gal、7 μL 20% IPTG和50 μg/mL氨苄青霉素）进行阳性克隆子筛选；提取pMD18-T-SOD/DH5α阳性克隆子菌株质粒用于测序，并利用ProtParam tool和ScanProsite在线软件对相应的氨基酸序列进行分析。
　　1.2.3 重组表达载体的构建 以限制性内切酶BamHⅠ与XhoⅠ分别对测序正确的重组质粒pMD18-T-SOD和表达载体pET-28a进行双酶切，其中重组质粒双酶切体系为20 μL（BamHⅠ 1 μL，XhoⅠ 1 μL，10×K Buffer 2 μL，重组质粒DNA 2 μL，无菌水14 μL）；表达载体双酶切体系为20 μL（BamHⅠ 1 μL，XhoⅠ 1 μL，10×K buffer 2 μL，表达载体质粒DNA 7 μL，无菌水9 μL）。采用1.5%琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下进行割胶回收；采用T4连接酶进行连接，连接体系为25 μL（10×T4连接酶Buffer 2.5 μL，T4连接酶1 μL，DNA片段0.3 pmol，载体DNA 0.03 pmol，加水至25 μL），于16 ℃连接16 h后，加入2.5 μL 3 mol/L醋酸钠（pH5.2）和62.5 μL预冷的无水乙醇，置于-20 ℃ 30～60 min；以12 000 r/min离心2 min，弃上清，加入预冷的70%乙醇，以12 000 r/min离心2 min，弃上清后吹干获得连接产物pET-28a-SOD。
　　1.2.4 超氧化物歧化酶基因的原核表达及活性测定
　　将连接产物pET-28a-SOD转化大肠杆菌DH5α感受态细胞后，挑选阳性克隆子于LB液体培养基（含50 μg/mL卡那霉素）中，以37 ℃、200 r/min振荡培养16～24 h；利用Omega质粒提取试剂盒提取转化子质粒DNA，采用双酶切进行验证，酶切体系及程序同上；挑取验证正确的阳性克隆菌落于LB液体培养基（含50 μg/mL卡那霉素）中，以37 ℃、200 r/min振荡培养2～3 h（OD600=0.6），加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG，以37 ℃、200 r/min振荡培养6 h；离心收集菌体，加入200 μL 2×电泳上样缓冲液悬浮菌体，置于沸水中水浴20 min，以12 000 r/min离心15 min，收集上清液直接进行SDS-PAGE电泳（方法参照Takara商品参考目录）。将pET-28a直接转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞后，挑取转化子，以37 ℃、200 r/min振荡培养6 h；离心收集菌体，加入200 μL 2×电泳上样缓冲液悬浮菌体，置于沸水中水浴20 min，以12 000 r/min 离心15 min，收集上清液作为对照。采用氮蓝四唑法测定离心收集的经IPTG诱导过夜的重组菌菌体裂解液中的SOD酶活性，重复3次。采用考马斯亮蓝法测定菌体中的蛋白质浓度，以牛血清白蛋白为标准蛋白[30]。
　2 结果与分析
　　2.1 短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX超氧化物歧化酶基因的克隆和序列测定
　　以短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX总DNA为模板，对SOD基因进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳结果显示，在约600 bp处有一条扩增产物条带，与预期相符合（图1）。回收SOD基因片段，与pMD18-T克隆载体连接后，获得连接产物，采用热击法转化导入大肠杆菌DH5α中；随机挑取阳性克隆子转接至含有氨苄青霉素抗性的液体培养基，以200 r/min、37 ℃振荡培养4～6 h，采用水煮法提取质粒DNA，利用pMD18-T的通用引物进行PCR扩增。电泳结果显示，经通用引物扩增后片段约为750 bp（图2），初步判断已成功克隆SOD基因；将其序列提交至NCBI数据库，获得登录号为KM255665；采用DNAMAN软件进行序列分析，发现该基因的ORF序列长度为609 bp；经与NCBI上相关序列比较发现，该SOD核苷酸序列仅与目前完成全基因组测序的短短芽胞桿菌NBRC 100599的SOD基因核苷酸相似度为99%。
　　利用DNAMAN翻译SOD基因得到202个氨基酸序列，通过与NCBI数据库比对，发现其与目前完成全基因组测序的短短芽胞杆菌NBRC 100599的SOD氨基酸序列相似度为99%，与侧胞芽胞杆菌、专性嗜碱芽胞杆菌、类芽胞杆菌的SOD氨基酸序列相似度分别为87%、78%、77%，表明短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX中的SOD基因具有种属特性。采用Protparam对该蛋白的相对分子质量、等电点等进行分析，结果表明，该SOD蛋白的相对分子质量为22 045.5，等电点为5.71。ScanProsite分析显示，该SOD是一个MnSOD，其不仅具有锰离子结合位点，还存在铁离子结合位点，而且还有一个天冬氨酸和组氨酸配体区域的短的保守区域。进一步进行蛋白二级结构分析，发现该蛋白具有螺旋、β-折叠和卷曲，如图3所示，其中H代表螺旋区，E代表β-折叠，C代表卷曲。
　　2.2 重组表达载体pET-28a-SOD的构建
　　将经双酶切后的SOD基因片段和同样处理的表达载体pET-28a进行连接，采用热击法转化大肠杆菌DH5α后，对获得的重组表达载体pET-28a-SOD进行PCR和双酶切验证。经1%琼脂糖凝胶电泳后发现，在约600 bp处有清晰条带（图4），将其初步鉴定为阳性转化子。进一步对阳性克隆中的重组质粒进行提纯，采用限制性内切酶BamHⅠ与XhoⅠ双酶切，电泳后在约600 bp处出现清晰条带（图5），确定其为阳性转化子。将获得的重组质粒进行测序，序列匹配率为100%，说明在重组表达载体的构建过程中，SOD基因并没有发生突变，且正确连接到表达载体pET-28a。
　　2.3 重组SOD的诱导表达及活性测定
　　将验证后的阳性转化子进行蛋白的诱导表达，IPTG诱导表达结果如图6所示。pET-28a-SOD菌体裂解液上清在25 ku处具有清晰条带，而菌液上清液和含有pET-28a质粒的菌体裂解液在25 ku处条带差异不明显，软件预测SOD蛋白大小约为22 ku，表明短短芽胞杆菌中SOD在大肠杆菌BL-21中顺利表达。采用氮蓝四唑法测定经IPTG诱导后的pET-28a-SOD菌体裂解上清液中的SOD酶活性，结果显示其酶比活为3 435.23 U/mg，表明从短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX中克隆的Mn-SOD在大肠杆菌中得到了高效的表达。
　　3 讨论
　　超氧化物歧化酶（SOD）在动植物和微生物中普遍存在，具有重要的应用价值，SOD的过量表达可明显提高植物的抗逆能力，增强植物对氧化胁迫的耐受性，利于转基因植物更好地适应逆境[31]，因而对SOD的研究也越来越深入[32]。短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX的SOD基因在线比对结果显示，其具有种属特性，基因序列仅与完成全基因组测序的短短芽胞杆菌NBRC 100599中SOD基因相似度为99%，与其他种属的相似度均较低，该结果与蜡状芽胞杆菌SOD基因序列比对相同，蜡状芽胞杆菌905铜锌超氧化物歧化酶基因片段为537 bp，Blast结果显示其与其它几株蜡状芽胞杆菌的SOD基因同源性在90%以上[33]。
　　微生物的需氧情况会影响SOD的含量、种类和分布[34]。好氧微生物中SOD的含量显著高于厌氧微生物，严格厌氧微生物则基本不含SOD[32]。此外，随着所处环境的不同，厌氧微生物中SOD也有所不同，无氧条件下，在脆壁芽胞杆菌、多形拟杆菌和大肠杆菌中可检测到FeSOD，而其在有氧条件下则具有较高的MnSOD活性[35]。本研究中获得的SOD类型为MnSOD，其蛋白中含有Fe离子和Mn离子配位区域，因此推测在有氧条件和无氧条件下，该菌株均可表现出SOD活性。
　　大肠杆菌pET表达系统是目前表达外源基因效率最高的表达系统之一，很多SOD基因均在该表达系统中表达。孟玲等[36]构建了耐辐射奇球菌Mn-SOD基因的原核表达重组质粒pET-SOD，并进行了原核高效表达，蛋白活性可达51 800 U/g湿菌体。将蜡样芽胞杆菌中的M22铜锌超氧化物歧化酶基因编码区插入表达载体pET-22b中，转化大肠杆菌BL-21，诱导表达的融合蛋白占菌体裂解液总蛋白的21.3%[37]。本研究将短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX的SOD基因进行克隆，与含有组氨酸标签的pET-28a质粒连接，并将其在大肠杆菌中进行原核表达，为该菌株SOD酶的研究和应用提供有利条件。
　　通过SOD酶活性测定发现，SOD酶主要存在于菌体裂解液上清液中，其酶比活最高为3 435.23 U/mg，该菌株SOD酶比活性明显高于其它菌株，如枯草芽胞杆菌MnSOD在原核表达中的酶比活为2 553.211 U/mg[28]；蜡状芽胞杆菌M22中的MnSOD在原核表达中的酶比活仅为156.65 U/mg[27]。短短芽胞杆菌SOD基因的成功克隆及原核表达对了解其生防机理具有重要作用，同时，为进一步研究芽胞杆菌SOD基因的酶学特性提供了基础数据。
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