2株毒死蜱降解菌的分离鉴定

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　随着中国彻底停止甲胺磷、对硫磷、甲基对硫磷、久效磷等5种高毒有机磷农药的生产、流通和使用，毒死蜱作为替代高毒有机磷类农药的主要有机农药品种，在中国应用日益广泛[2]。虽然毒死蜱属于中毒农药，但对于多数水生生物、蜜蜂仍属于高毒性物质[3-4]；加之其作为一种异源有毒物质，有较高的土壤吸附性及水体中较长的半衰期，会以食物链及地下水形式传递，对人体造成危害。近年来，残留毒死蜱对动物造成的伤害及其降解等问题已经引起人们的重视[5-7]。
　　土壤微生物的降解代谢作用是毒死蜱消失的最主要因素。国内外已经分离到很多能降解毒死蜱的细菌和真菌，如Rhodopseudomonas sp. 07-26，Bacillus cereus sp. HY-2与HY-4，Stenotrophomonas sp.，Hafnia sp.，Trichoderma sp.等[8-12]，并對降解毒死蜱的微生物代谢途径有了一定的了解。但菌株在大田土壤修复中普遍由于无法复制实验室培养环境，难以长时间保持数量优势，严重影响其发挥降解作用；对于土壤中难降解的有机污染物，因不同微生物的代谢方式可以互补，如采用定殖能力较高的混合菌株，将会提高降解效率[13]。基于上述原因，本研究试图从活性污泥中分离鉴定降解效率较高、定殖能力较强的毒死蜱降解菌株，为毒死蜱污染土壤的治理提供新的资源和思路。
　　1 材料与方法
　1.1 材料
　　E. coli DH5α：本实验室保存。
　　基础盐培养基（MSM，g/L）：NH4NO3 1.0、KH2PO4 0.5、K2HPO4 1.5、NaCl 1.0、MgSO4·7H2O 0.2，pH7.0。固体培养基添加1.5%琼脂。
　　LB培养基（g/L）：胰蛋白胨10、酵母粉5、NaCl 10、去离子水1 000 mL。固体培养基添加1.5%琼脂。
　　毒死蜱原药（95%）购自山东华阳农药化工集团有限公司。二氯甲烷（AR），甲醇（AR）购自上海化学试剂厂。各种试剂标准品购自百灵威公司。
　　1.2 方法
　　1.2.1 毒死蜱降解菌株的分离与筛选 富集污泥取自海南某农药厂废水处理池。在100 mL含50 mg/L毒死蜱的MSM培养基中加入5 g污泥，振荡均匀，将富集液置于摇床，30 ℃，160 r/min振荡培养5 d。吸取5 mL富集液转接至新鲜的含100 mg/L毒死蜱的MSM培养基中，30 ℃，160 r/min振荡培养，连续传代。将第4代富集液做梯度稀释，稀释液分别涂布在LB固体平板和加入100 mg/L毒死蜱的基础盐培养基平板，30 ℃培养3～6 d，待平板出现单菌落后，挑取菌落形态不同的单菌落在相应的培养基平板上划线纯化，直至单菌落形态一致且细胞染色在显微镜下观察形态一致。
　　1.2.2 菌株形态及生理生化鉴定、菌株16S rRNA序列分析及系统发育地位的确定 降解菌株菌落形态、生理生化特征的确定参照《常见细菌系统鉴定手册》[14]和《Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology》[15]进行。
　　菌体总DNA采用改良的CTAB法提取[16-17]。菌株16S rRNA基因的PCR扩增以细菌的基因组DNA为模板，采用通用引物。正向引物为5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物为5′-TACCTTGTTACGACTT-3′[18]。
　　扩增体系（25 μL）如下：10×Buffer 2.5 μL，Mg2+（25 mmol）2.0 μL，dNTPs（2.5 mmol each）2.5 μL，正向引物（1 mmol）0.5 μL，反向引物（1 mmol）0.5 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.3 μL，灭菌双蒸水至25 μL。
　　PCR扩增反应程序为：95 ℃预变性2 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，72 ℃ 10 min，30 cycles；10 ℃ 10 min。PCR產物通过1%，GoldView染色的琼脂糖电泳后，紫外分析仪检测。用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒回收基因片段，TA克隆后进行测序（由华大基因完成）。根据16S rRNA基因的测序结果，在http：//eztaxon-e.ezbiocloud.net/在线查询分析[19]，下载同源性较高的序列用MEGA version 5.0软件通过邻接法[20]构建降解菌株的16S rRNA基因系统进化树[21]。
　　1.2.3 菌株降解效果的测定 将待测菌株在50 mL LB液体培养基中培养到对数生长期后期，培养液于离心机中5 000 r/min离心10 min，菌泥用基础盐培养基洗涤2次，调节OD600 nm为5.0作为接种液，以2%的接种量将菌悬液接种于含100 mg/L毒死蜱的MSM液体培养基中，30 ℃，160 r/min培养72 h，每8 h取样1次，验证菌株对毒死蜱的降解效果，每个梯度设不加菌空白对照，并做3个重复。
　　采用紫外扫描法快速定性检测样品中毒死蜱浓度，精确定量检测样品中毒死蜱浓度采用GC-MS法。按1 ∶ 1比例在培养液中加入二氯甲烷，剧烈振荡90 s，室温下静置5 min，这时水相和有机相充分分离，将水相吸出丢弃，加入无水硫酸钠至有机相，除去有机相中少量水分。用UV-2450PC型分光光度计在200～350 nm波长范围内进行扫描（毒死蜱特征吸收峰约为290 nm处）。吸取1 mL振荡分离后二氯甲烷提取液于室温下挥发干，加入1 mL色谱纯正己烷溶解，稀释，经0.22 μm有机滤膜过滤后，利用GC-MS检测。Agilent7890A+5975C，流速1.2 mL/min，分流比40 ∶ 1，进样口温度280 ℃，检测器温度290 ℃，柱温150 ℃保持1 min，以10 ℃/min升至250 ℃后保持20 min。根据标准曲线计算样品中毒死蜱的含量，得出毒死蜱的降解率。所有试验数据采用SPSS 13.0软件进行方差分析。
　　1.2.4 菌株最佳混合比例确定 2菌株均调OD600 nm值为2.0，以1 ∶ 3、1 ∶ 2、1 ∶ 1.5、1 ∶ 1.25、1 ∶ 1、1 ∶ 0.75、1 ∶ 0.5、1 ∶ 0.25体积比混合，5%接种量，初始毒死蜱浓度为100 mg/L，30 ℃，160 r/min培养72 h，验证菌株对毒死蜱的降解效果，每个梯度设不加菌空白对照，并做3个重复。
　　1.2.5 混合菌株对毒死蜱的降解特性研究 培养温度对混合菌株降解毒死蜱的影响：将混合菌株以体积比1 ∶ 1.25，5%接种量，接种到100 mL基础盐培养基中，加入毒死蜱使终浓度为100 mg/L，分别置于不同的培养温度下（20、25、30、35、40、45 ℃）培养72 h，分别测定各样品残留毒死蜱浓度，计算降解率，每个梯度设不加菌空白对照，并做3个重复。
　　培养基pH值对混合菌株降解毒死蜱的影响：将混合菌株以体积比1 ∶ 1.25，5%接种量，接种到100 mL基础盐培养基中，加入毒死蜱使终浓度为100 mg/L，置于不同pH值（5.0、6.0、7.0、7.5、8.0、9.0）的培养基中，30 ℃培养72 h，分别测定各样品残留毒死蜱浓度，计算降解率，每个梯度设不加菌空白对照，并做3个重复。
　培养基NaCl浓度对混合菌株降解毒死蜱的影响：将混合菌株以体积比1 ∶ 1.25，5%接种量，接种到100 mL液体LB培养基中，加入毒死蜱使其终浓度为100 mg/L，培养基中NaCl浓度分别为0、0.5%、1%、1.5%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、8.0%、10.0%，置于30 ℃，pH7.0条件下培养72 h，每個梯度设不加菌空白对照，并做3个重复。
　　初始毒死蜱浓度对混合菌株降解毒死蜱的影响：将混合菌株以体积比1 ∶ 1.25，5%接种量，接种到100 mL基础盐培养基中，加入不同量毒死蜱，使其终浓度分别为50、75、100、150、200、300 mg/L，30 ℃培养72 h，分别测定各样品残留毒死蜱浓度，每个梯度设不加菌空白对照，并做3个重复。
　　1.2.6 混合菌液在土壤中对毒死蜱的降解试验
　　取海口市从未施用过毒死蜱的菜田表层土壤（pH6.12），分设2组，A组121 ℃灭菌2 h，B组不灭菌。将所有土样过2 mm筛，取一定量的毒死蜱溶于丙酮，将其均匀拌入装有1 000 g土壤的塑料盆中，A、B组各设2个处理：（1）每盆土壤中毒死蜱终浓度为10 mg/L；（2）每盆土壤中毒死蜱终浓度为50 mg/L。制备新鲜的混合菌株菌液，5 000 r/min离心5 min后，收集菌体，用无菌去离子水洗涤3次后再用无菌水悬浮，调节菌体浓度约为1.0×109 cfu/mL。以10%接种量接入到上述土壤中，于30 ℃恒温黑暗培养箱中培养，每个处理设不接种降解菌的土壤作为对照，并做3个重复。期间所有土壤的持水量保持在60%，培养10 d后，通过GC-MS测定土壤中的毒死蜱残留量。
　　2 结果与分析
　　2.1 毒死蜱降解菌株的分离与筛选
　　经紫外扫描及GC-MS测定，发现富集液中91%的毒死蜱已被降解。将富集液梯度稀释培养，得到2株可降解毒死蜱的细菌，命名为D1与D3。2株菌均能在初始浓度为100 mg/L毒死蜱的基础盐培养基中生长并降解毒死蜱，72 h降解率约为77%与63%。
　　2.2 菌株形态及生理生化鉴定、菌株16S rRNA序列分析及系统发育地位的确定
　　菌株D1菌落在LB平板上呈乳白色、光滑、圆润、不透明、有光泽，2 d后菌落直径约1 mm；在透射电子显微镜下观察，该菌呈短杆状，每菌有极生或周生鞭毛。
　　该菌为革兰氏阴性菌，好氧，可利用D-葡萄糖、果糖、L-阿拉伯糖、肌醇为碳源生长，过氧化氢酶、细胞色素酶反应为阳性，吲哚产生、葡萄糖酸化、明胶液化反应为阴性。
　　菌株D1的16S rRNA基因系统发育树见图1，结果表明菌株D1与苍白杆菌属（Ochrobactrum sp.）有较高的同源性，与Ochrobactrum tritici SCII24T（AJ242584）亲源关系最近，16S rDNA基因相似性为99.63%；并且在基因系统发育树上菌株D1和Ochrobactrum cytisi ESC1T（AY776289）、Ochrobactrum anthropi ATCC 49188T（CP000758）、Ochrobactrum lupini LUP21T（AY457038）聚类在一个亚分支上。结合其生理生化特性及16S rRNA序列分析结果，将菌株D1鉴定为苍白杆菌属（Ochrobactrum sp.）。
　　菌株D3菌落在LB平板上呈浅黄色的圆润凸起，2 d后菌落直径约2 mm，在透射电子显微镜下观察，该菌呈球形或短杆状，无鞭毛。
　　该菌为革兰氏阴性菌，兼性厌氧，可利用D-葡萄糖、阿拉伯糖、D-甘露醇、D-山梨醇为碳源生长，过氧化氢酶、细胞色素酶、葡萄糖酸化反应为阳性，吲哚产生、明胶液化反应为阴性。
　　菌株D3的16S rRNA基因系统发育树见图2，结果表明菌株D3与副球菌属（Paracoccus sp.）有较高的同源性，与Paracoccus huijuniae FLN-7T （EU725799）亲源关系最近，16S rDNA基因相似性为98.82%；并且在基因系统发育树上菌株D3和Paracoccus aminovorans JCM 7685T（D32240）、Paracoccus siganidrum M26T（JX398976）、Paracoccus alcaliphilus JCM 7364T（D32238）聚类在一个亚分支上。结合其生理生化特性及16S rRNA序列分析结果，将菌株D3鉴定为副球菌属（Paracoccus sp.）。
　　2.3 菌株最佳混合比例确定
　　将2菌株按不同比例混合进行降解试验，降解率的变化见图3。结果表明菌株D1和D3的混合体积比变化对毒死蜱降解影响较大。随着D1所占比例增加，混合菌株对毒死蜱的降解率升高；当2菌株的体积比为1 ∶ 1.25时，毒死蜱的降解率达到89%以上；但是随着体积比继续增加，降解率开始降低。因此2菌株接种体积比确定为1 ∶ 1.25。
　　2.4 混合菌株以毒死蜱为唯一碳源的生长和降解试验
　　将菌株D1、D3按1 ∶ 1.25接种到含100 mg/L毒死蜱为唯一碳源的基础盐培养基，进行毒死蜱降解试验。通过对30 ℃，160 r/min培养72 h的培养液进行紫外扫描及GC-MS分析，结果见图4。菌株混合液在72 h内对毒死蜱的降解率达到89%以上，比单菌降解效率分别提高约12%和26%。同时，在毒死蜱的降解过程中，2株菌培养液的OD600 nm也随着毒死蜱的降解而增加，表明菌株D1、D3在降解毒死蜱的同时，能够利用毒死蜱作为唯一碳源生长。
　　2.5 混合菌株对毒死蜱的降解特性研究
　　2.5.1 培养温度对混合菌株降解毒死蜱的影响
　　如图5所示，菌株D1与D3混合液在20～40 ℃皆能降解毒死蜱，在25～35 ℃降解情况较好，降解率皆能达到61%以上，在20～25 ℃或35～40 ℃降解效率急剧下降，但降解率仍为20%以上；菌株混合液对毒死蜱最适降解温度为30 ℃，降解率约为89%。
　2.5.2 培养基pH值对混合菌株降解毒死蜱的影响
　　如图6所示，菌株D1与D3混合液在pH=6～8范围内皆能较快降解毒死蜱，在pH=7～8降解情况较好，pH值在5以下或9以上降解效率急剧下降，降解率仅为22%左右。菌株混合液对毒死蜱最适降解pH值为7.0，降解率约为87%。
　　2.5.3 培养基NaCl浓度对混合菌株降解毒死蜱的影响 如图7所示，混合菌株在NaCl浓度为0～8%时皆能降解毒死蜱，在NaCl浓度为0.5%～1.5%时降解情况较好，在NaCl浓度为3%以上时，因混合菌株生长受到严重抑制，降解率下降，在NaCl浓度为8%以上时，混合菌株几乎不生长，降解也几乎停止。混合菌株对毒死蜱降解最适培养基NaCl浓度为0.5%，在此浓度下，降解率约为83%。
　　2.5.4 初始毒死蜱浓度对混合菌株降解毒死蜱的影响
　　如图8所示，当初始毒死蜱浓度为150 mg/L或以下时，混合菌株对毒死蜱的降解率都为80%以上，初始浓度对混合菌株的降解影响不大；但当初始毒死蜱浓度在300 mg/L或以上时，混合菌株几乎不降解毒死蜱，说明太高浓度的毒死蜱可能对菌体生长产生毒性，从而严重影响混合菌株降解毒死蜱。
　　2.6 混合菌液在土壤中对毒死蜱的降解试验
　　如图9所示，与各自对照相比，在灭菌土壤（A组）中，混合菌液對2个浓度的毒死蜱均保持较高的降解率，培养10 d后，初始毒死蜱浓度为10 mg/L的处理（A1）和50 mg/L的处理（A2）降解率分别为（84.3±4.09）%和（76.9±5.23）%；在未灭菌土壤（B组）中，初始毒死蜱浓度为10 mg/L的处理（B1）和50 mg/L的处理（B2）降解率分别为（71.7±2.39）%和（59.2±3.31）%，降解效率低于灭菌土壤的处理。该结果表明由于土壤中存在其他微生物，混合菌株对毒死蜱的降解作用明显受到影响；且初始毒死蜱浓度越高，混合菌株受影响越大。在灭菌和未灭菌土壤中，混合菌株对毒死蜱的降解差异显著，但降解率都保持在较高水平，达到59%以上。
　　3 讨论
　　毒死蜱对于多数水生生物、蜜蜂属于高毒性物质，加之其在土壤中残留时间较长，将会以食物链形式对人体造成危害；大量研究表明，微生物代谢是土壤中毒死蜱降解的最主要因素。目前国内外已经报道了很多毒死蜱降解菌，在分类上大部分属于真菌中的木霉菌属及细菌中的假单胞菌属、芽孢杆菌属、寡养单胞菌属、哈夫尼菌属、气单胞菌属[8-12，22]。本研究分离筛选到2株可降解毒死蜱，并能以毒死蜱为唯一碳源生长的细菌D1、D3，通过生物学特性和16S rRNA基因序列相似性分析，将其鉴定为苍白杆菌属（Ochrobactrum sp.）和副球菌属（Paracoccus sp.），且2株降解菌均对毒死蜱具有较高的降解效率，72 h内对100 mg/L毒死蜱的降解率约为77%与63%；虽低于Stenotrophomonas sp.YC-1[10]，但显著高于已报道的大部分毒死蜱降解细菌。
　　毒死蜱在土壤中的降解受酸碱度影响。单因素试验表明，毒死蜱在酸性土壤中降解较慢[23]；热带土壤多为酸性土壤，因此，降解菌在酸性土壤中的定殖能力直接影响其在大部分热带土壤中的降解效率。对于土壤中难降解的有机污染物，因不同微生物的代谢方式可以互补，如采用定殖能力较强的混合菌株，将会提高其降解效果。本研究筛选得到的2株降解菌D1、D3以一定比例（1 ∶ 1.25）混合施用，与单菌相比，对毒死蜱降解能力显著提高；在无外加营养元素或者较高浓度毒死蜱胁迫条件下，混合菌株均能保持较强的降解能力。本研究酸性土壤试验结果表明，虽因混合菌株等非土著微生物的降解效率易受土著微生物的影响而有所下降，导致在灭菌和未灭菌土壤中，混合菌株对毒死蜱的降解差异显著，但无论在灭菌或未灭菌土壤中，混合菌株都保持着较高的降解效率，具有较好的定殖能力。本研究得到的混合菌株具有应用开发潜力，在实际应用过程中，可进一步通过提高接种剂量，调整土壤pH值等措施，提高混合菌株的定殖能力及对毒死蜱的降解效率，研发出可实际应用的降解菌剂。很多降解菌株因为其在自然条件下定殖能力较低，在农业生产上还没有得到有效应用，本试验结果为降解菌在土壤中定殖能力的提高提供了新的研究思路。
　　本研究分离鉴定了2株具有较高降解效率的毒死蜱降解菌，并发现2株菌以最佳配比混合施用时，与单菌相比，毒死蜱降解效率可显著提高；进一步研究了培养温度、pH、NaCl浓度、初始毒死蜱浓度对混合菌株降解毒死蜱的影响，及混合菌液在土壤中对不同浓度毒死蜱的降解效率，可为毒死蜱污染热带土壤的治理提供资源与理论基础。
　　参考文献
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