木薯细菌性枯萎病的生防菌株筛选

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1 材料与方法
　　1.1 材料
　　取样地点：样本于2014年8月份采集于广东省湛江遂溪某木薯园。
　　病原菌来源：本研究室保存的病原菌，于2013年采集于广东湛江遂溪某木薯地，分离于木薯发病叶片和茎秆，纯化、保存，通过比对菌落形态、16s RNA测序分析，鉴定为地毯草黄单胞木薯萎蔫致病变种（Xanthomonas axonopodis pv. manihotis，简称Xam）。
　　1.2 方法
　　1.2.1 样本采集和菌株分离 样本采集：CBB发病地块和非发病地块。每块地分成4个小区，每个小区至少有250 m2，每个小区的样本由5个重复混合而成。土壤取样时，深度为0～15 cm，面积约1 m2。采用五点采样法，每点间隔至少10 m。每点3株健康植株连同根围土一并收集。采集后的样品迅速装入写好编号的塑料袋中带回实验室进行分离。参考Morris等[9]的方法取样：A. 无病害地块的健康植株；B. 无病害地块的健康植株根围土；C. 无病害地块的根际土；D. 病害地块的健康植株；E. 病害地块的病株（病株上的健康部位叶片）；F. 病害地块健康植株的根围土；G. 病害地块染病植株的根围土；H. 病害地块的根际土。以及另一地块（吴川唐缀，新地，第一年种植木薯）的健康叶片及其茎秆的中空部分。
　　外生细菌分离[10]：取3 g样品，放入灭菌的三角瓶中，加27 mL无菌的0.85% NaCl和灭菌玻璃珠，于摇床上150 r/min振荡30 min后，静置5 min，得到10-1稀释液，依次制备成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6稀释液。分别取10-4、10-5、10-6三个梯度的稀释液100 μL涂在R2A培养基（R2A培养基（1 L）：酵母粉0.5 g，酪蛋白胨0.25 g，肉蛋白胨0.25 g，水解酪蛋白0.5 g，葡萄糖0.5 g，淀粉0.5 g，丙酮酸鈉0.3 g，磷酸氢二钾0.3 g，水合硫酸镁0.024 g，琼脂15 g，pH=7.2）上，每个梯度3个重复，30 ℃培养48 h。
　　内生细菌分离[10]：分别取样品若干，用1%的次氯酸钠浸泡5 min，70%酒精浸泡1～2 min，无菌水清洗3次（取最后1次清洗的溶液100 μL涂于R2A平板上，若48 h后无菌生长则认为表面消毒干净，无菌）。其他同外生菌的分离方法。
　　选菌落数在30～300个的平板，计数，挑取平板上不同大小、形态的菌落分离、纯化，40%甘油保存于-70 ℃超低温冰箱中，备用。
　　1.2.2 产酶和代谢产物活性测定
　　（1）蛋白酶活性测定。参照Yang等[10]的方法，挑取处于生长旺盛期的菌株接种于蛋白培养基平板上（A：脱脂奶粉6.4 g，溶于240 mL水中，121 ℃灭菌1 min；B：琼脂6.4 g，定容至240 mL，121 ℃灭菌20 min，A与B分别灭菌后混合），30 ℃培养3 d，观察透明圈且测量内径和外径，4个技术重复，3次试验平行重复，下同。
　　（2）几丁质酶活性测定。参照Roberts等[11]的方法，制备好胶体状几丁质，将颉颃细菌接种在以胶体状几丁质为唯一碳源的Chi-Ayers培养基平板（NH4H2PO4 1.0 g，KCl 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，胶体状几丁质1%（w/V）定容至1 000 mL，pH=7.0，琼脂20 g），30 ℃培养3 d，观察透明圈且测量内径和外径。
　　（3）β-1，3-葡聚糖酶活性的检测。参照杨威[12]的方法，将颉颃细菌接种在葡聚糖平板上（β-1，3-葡聚糖0.1 g，TSB 0.4 g，琼脂1.6 g，4 g/L的刚果红1 mL，定容至100 mL），30 ℃培养48 h，观察透明圈且测量内径和外径。
（4）纤维素酶活性的检测。参照Ghose[13]的方法，把准备好的菌株接到纤维素酶活性测定平板（蛋白胨10 g，酵母粉10 g，羧甲基纤维素钠10 g，氯化钠5 g，磷酸二氢钾1 g，琼脂18 g，定容至1 000 mL，pH=7.0），30 ℃培养48 h后，用1 g/L的刚果红染1 h后，倒掉染液后，用1 mol/L的NaCl浸泡1 h。观察透明圈的有无且测量其内径和外径。
　　（5）产嗜铁素活性的检测。参照Shin等[14]的方法，将A，B液混合倒平板，并将准备好的菌株接于该平板上[A：1，60.5 mg CAS（铬天青S）溶于50 mL去离子水；2，10 mL三价铁溶液（1 mmol/L FeCl3·6H2O，10 mmol/L盐酸为溶剂）；3，72.9 mg HDTMA溶于40 mL去离子水。上述3个溶液混合定容至100 mL，pH调至中性，121 ℃灭菌20 min。B：30.24 g Pipes加入900 mL Waker agar培养基，12 g 50%（w/V）的NaOH溶液将培养基pH调至6.8，121 ℃灭菌20 min]，30 ℃培养3 d，观察透明圈且测量内径和外径。
　　（6）产吲哚乙酸测定。参照Sawar等[15]的方法，取二甲氨基苯甲醛8 g溶于760 mL 95%酒精和160 mL浓盐酸中，制得埃利希氏试剂。以1%胰蛋白胨水（pH=7.2～7.6）为培养液，2 d后将培养好的菌液加入3～5 mL埃利希氏试剂，观察液面是否变红。
　　1.2.3 平板颉颃活性测定 参照杨威[12]的方法，将病原菌接种到LB培养液中，28 ℃、200 r/min、22 h震荡培养，制成种子液，以5%的接种量接种到LB液中，28 ℃，200 r/min，24 h培养成发酵液。随后将病原菌发酵液以5%的比例接种到LB固体培养基中（待LB固体培养基冷却至37～45 ℃加入此比例的病原菌菌液），制成含病原菌的平板，每皿加入15 mL。
　　随后将预先培养好的细菌培养液分别吸取8 μL于灭菌滤纸片（直徑为5 mm）上，以LB培养液和灭菌水为空白对照。28 ℃培养48～72 h，观察并测量抑菌圈大小。每个处理4个技术重复，3个试验重复。
　　1.2.4 赋值评估 本赋值系统包括如下指标：平板颉颃活性、蛋白酶活性、几丁质酶活性、纤维素酶活性、葡聚糖酶活性以及产嗜铁素、吲哚乙酸活性。其中赋值方法如下[16]：平板颉颃活性根据颉颃圈（颉颃圈外径与内径之差）的大小分为四级：0，无颉颃活性；1，颉颃圈在1～3 mm之间（含3 mm）；2，颉颃圈在3～6 mm之间（含6 mm）；3，颉颃圈大于6 mm。赋予的值分别为0、1、2、3。水解酶和产生嗜铁素赋值方法：0，无水解圈；1，水解圈在1～3 mm之间（含3 mm）；2，水解圈在3～6 mm之间（含6 mm）；3，水解圈大于6 mm，依次赋值对应为0、1、2、3。吲哚乙酸活性根据液面颜色变化赋值如下：0，不变色；1，浅红色；2，红色；3，深红色。
　　1.2.5 指纹图谱和16S rRNA测序和聚类分析
　　利用细菌基因组试剂盒（Shanghai SBS Genetech Co. Ltd）提取细菌基因DNA后，参考杨明明等[17]的方法，分别进行扩增核糖体DNA限制性酶切分析（amplified ribosomal DNA restriction analysis， ARDRA）和BOX-PCR扩增。利用软件对所得图谱进行聚类分析。
　　试剂盒（赛百盛公司）提取细菌基因组后，参考Yang等[10]的方法从基因组中扩增出16S rRNA基因片段的PCR扩增。所得产物在华大基因测序分析，并将相关序列在NCBI上进行比对。
　　1.2.6 防效测定 （1）温室试验测定。试验品种为“南植199”。本试验设置12个处理：A. 108 CFU/mL菌剂（11个）发酵液10倍稀释液；B. 对照：同等稀释倍数的LB溶液。每处理设4个重复，每个重复3棵苗。菌剂和对照处理组每株苗喷施30 mL，对照组用等量LB和灭菌水以相同方法喷雾；以上各处理组在喷雾时均加入终浓度为0.01%的表面活性剂Tween-20。喷施5 d后以剪叶的方式接种浓度为107 CFU/mL的病原菌[18]。接种病原菌21、23、25、28 d分别，调查病害严重度并计算生防效果。
　　病害调查方法：0级为叶片无病斑；1级为病斑占叶面积1/10以下；3级为病斑占叶面积 1/10～1/4；5级为病斑占叶面积1/4～1/2；7级为病斑占叶面积1/2～3/4；9 级为病斑占叶面积 3/4以上。
　　病情指数和生防效果统计计算方法：病情指数=[∑（病级数×该病级植株数）/（最高病级×总植株数）]×100；生防效果=[（对照病情指数-处理组病情指数）/对照病害严重度]×100。
　　（2）田间防效试验测定。试验品种为“南植199”。本试验设置6个处理：A. 108 CFU/mL菌剂（5个）发酵液稀释10倍；B. 对照：同等稀释倍数的LB溶液。每处理设4个重复，每个重复3棵苗。菌剂、病原菌接种、调查方法、统计病害方法同温室大棚盆栽防效测定相同。接种病原菌25、29、31、35 d分别，调查病害严重度并计算生防效果。采用随机区组设计。
　　1.3 数据处理
　　在Microsoft Excel中对平板的抑菌圈、酶活、病害严重度、防效等数据进行基础处理。用分析软件DPS v7.05进行数据分析，实验结果为平均值±SD，通过One-Way ANOVA Analysis、LSD Test（p<0.05）进行方差和显著水平分析。
　　2 结果与分析
　　2.1 各生境细菌的分离结果
　　本实验样品主要来自木薯几个不同生境，针对每个生境植物组织的根茎叶进行样本的分析处理，如表1。随后对这些生境处理中细菌种群密度和数量进行分析，发现存在差异；种群密度最高的为DDWR（病害地块的病株上健康部位-根-外生菌），达1.2×107 CFU/g FW；最低的为DHNY（病害地块的病株上健康部位-叶-内生菌），为1×104 CFU/g FW；从HWR（无病害地块的健康植株-根-外生菌）中分离到细菌的比例最高，为7.72%，DHNY（病害地块的健康植株-叶-内生菌）和HNYT（吴川唐缀健株叶片-内生叶）中则分离菌株数量较少，分别为1.34%和0.34%（表1）。总趋势为，外围细菌的种群密度和数量均高于内生菌株；根围菌株的高于叶片和茎部；而土壤中分离菌株的丰度则高于植株（叶、茎、根）。
　2.2 细菌产水解酶、次生代谢物及颉颃活性结果
　　将分离的298株细菌就其产酶活性和产次生代谢产物进行分析，结果显示，其中160株具蛋白酶活性，7株具几丁质酶活性，203株产嗜铁素，57株产纤维素酶，11株产葡聚糖酶，150株细菌能产生长素。其中产嗜铁素的菌株最多，占总菌株数的68.12%，产几丁质酶的菌株最少，仅为2.35%，产蛋白酶、纤维素酶、葡聚糖酶和生长素的细菌比例分别为53.69%、19.13%、3.69%和50.34%（表2）。
　　颉颃活性测定结果表明，9株细菌具有颉颃活性，占总菌株数的3.02%，这些菌株分别来自HWS、HWY、HWR、DHW和SHNR五种生境，其中来自HWS的分离菌株中具有頡颃活性的菌株比例最高，达18.8%，其次为HWY中分离得到的颉颃菌株，占14.3%。在HWR、DHW和SHNR生境中则分别为8.7%、7.1%和7.7%（表2）。
　　对298株生防潜力菌株（BCAs，Biological Control Agents）的酶活性、次生代谢物和平板颉颃活性进行赋值，根据得分及菌株分离生境等综合因素，选择其中88株BCAs进行16s RNA测序和指纹图谱分析。
　　2.3 聚类分析和赋值评估
　　测序和ARDRA、BOX-PCR图谱分析，88个菌株分别来自以下21个簇（属）：G1葡萄球菌属（Staphylococcus sp.）、G2微球菌属（Micrococcus sp.）、G3泛菌属（Pantoea sp.）、G4黄单孢菌属（Xanthomonas sp.）、G5假单胞菌属（Pseudomonas sp.）、G6不动杆菌属（Acinetobacter sp.）、G7埃希氏菌属（Escherichia sp.）、G8短杆菌属（Brevibacterium sp.）、G9克洛诺斯氏菌属（Cronobacte sp.）、G10芽孢杆菌属（Bacillus sp.）、G11类诺卡氏菌属（Nocardioidaceae sp.）、G12类芽孢杆菌属（Paenibacillus sp.）、G13微小杆菌属（Exiguobacterium sp.）、G14苍白杆菌属（Ochrobactrum sp.）、G15短小杆菌属（Curtobacterium sp.）、G16金黄杆菌属（Chryseobacterium sp.）、G17肺炎杆菌属（Klebsiella sp.）、G18肠杆菌属（Enterobacteria sp.）、G19伯克霍尔德菌属（Burkholderia sp.）、G20小细菌属（Microbacterium sp.）、G21丛毛单胞菌属（Comamonas sp.）。进一步分析，发现21个属（簇）的细菌所占比例存在差异（图1），其中以以G10芽孢杆菌属的丰度最好，所占比例为26.14%，其次是G18和19（9.09%），G20、G16和G17（7.95%），最低的为G1＼2＼7＼8＼9＼11＼12＼13＼14（1.14%）。
　　对88株颉颃细菌进行综合赋值评估，结果见表3，得分范围为1～13分，得分最高菌株为HNR3-7和HYW3-9，得分分别分布如下：1分（16个，18.18%），2分（6个，6.82%），3分（7个，7.95%），4分（7个，7.95%），5分（15个，13.64%），6分（12个，13.64%），7分（8个，9.09%），8分（1个，1.14%），9分（3个，3.41%），10分（7个，7.95%），11分（3个，3.41%），12分（1个，1.14%），13分（2个，2.27%）。大多菌株得分分布在5～7分。
　　结合以上综合数据，选择其中11个菌株进行温室盆栽防效测定。这11个菌株得分情况分别如下（表3），得分最高为HNR-3-7，可产生纤维素酶、蛋白酶，具有较好的嗜铁素分解能力，且有平板颉颃作用；得分中等且有较好颉颃作用的菌株有HWY-3-1、HWS-4-3；这3个菌株还来自同一个属（G10），经菌株鉴定分析，它们均属于Bacillus sp.。来自另一簇的菌株HWYT-3-2，得分最低，为2，仅产生嗜铁素，鉴定为Brevibacterium sp.
　　可见，选择的这11个待开展温室盆栽防效测定的菌株，种类较为丰富，且产酶种类存在差异，平板颉颃效果亦不相同。
　　2.4 防效测定
　　温室接种病原菌后21～28 d调查病害情况（表4），发现防效较好菌株为HWY-3-1、HWYT-3-2、DBS-5，防效在100%～64.40%间。对21～28 d的防效进行平均系数分析，结果显示，HWY-3-1防效为100%，植株并没发病，和对照相比，差异显著；防效在60%以上的菌株有DBS-5（85.96%）、HS-4-3（82.88%）、DHWP-1（79.37%）、HWYT-3-2（77.88%）、HWS-4-3（77.84%）、DHNS-3-5（65.34%）、DHWR-5-1（61.83%），和对照的防效相比，差异也显著；防效较差的菌株为HNR-3-7（0.17%）和HNR-4-3（44.14%），均为Bacillus amyloliquefaciens，它们和对照间防效的差异不也显著。
　　根据温室防效结果，选择其中5株细菌测定其田间防效作用（表5），来自不同生境，分别为HWY-3-1（Bacillus pumilus）、HNR-3-7（Bacillus amyloliquefaciens）、DHNS-3-5（Curtobacterium citreum）、HS-4-3（Enterobacter sp.）、DBS-5（Microbacterium arborescens），其中HNR-3-7的盆栽防效较差，但因其具有较好的纤维素降解和糖化水平[19]，故也作为田间防效的测试菌株。
　　在田间，接种病原菌后25 d调查，结果显示，防效较好菌株为HWY-3-1、HNR-3-7和DBS-5，防效在74.20%～36.42%。对25～35 d的防效进行平均系数分析，结果显示，HWY-3-1平均防效为38.11%，与对照的防效存在显著差异；HNR-3-7（25.31%）、DBS-5（7.90%）和HS-4-3（19.73%）防效和对照存在差异，但不显著。
　3 讨论
　　木薯细菌性枯萎病对木薯产业具有毁灭性危害，严重威胁木薯的产量及品质，寻找有效防治该病害的措施尤为重要。生物防治中以菌防菌，成为一种发展趋势，对我国农业可持续发展具有巨大意义[20-21]。其中利用有益微生物调控植物病害具有可持续性且对环境友好[22-23]。生物防治首要任务是优质的潜在生防菌株分离、筛选。目前，大部分筛选策略多是基于离体条件下菌株对病原菌的颉颃活性开展[24]。但平板具有较好颉颃活性的菌株，大约1%的菌株能在温室实验中表现生防效果，而这个比例到了田间会更少[10]。因此，筛选策略是生物防治面临的难点。
　　生防菌株对病害的控制一般是多种机理综合作用的结果，如营养竞争，主要是铁离子的竞争；生态位的竞争，主要是定殖效应影响微生态群落多样性；产生抑菌物质；诱导植物抗病体系。在筛选过程中，一般首先测定菌株颉颃活性，再测定颉颃活性较好菌株酶活性，必然会忽略很多无颉颃活性但可能具有较好酶活性的潜力菌株，而它们可能可诱导植物抗性。此外，由于分离方法的局限性，分离中不可避免存在重复菌株。通过ARDRA和BOX指纹图谱分析并结合16s RNA测序分析，从遗传学角度上进一步优化分析分离菌株，尽可能有效去除重复菌株[12]。本研究中，我们建立一套针对CBB生防菌株筛选系统，统筹颉颃和酶活性以及指纹图谱分析数据，采取赋值评估，优选潜在生防菌株，测定生防效果。通过温室盆栽和田间防效结果证明了我们假设的这套筛选系统的可行性。来自3个不同簇的菌株HWY-3-1（G10）、HS-4-3（G18）和 DBS-5（G20），温室防效依次为100%、82.88%和 85.96%；赋值得分依次为7、3、6，其中HWY-3-1可产生嗜铁素和蛋白酶以及具有平板颉颃活性；HS-4-3则可产生葡聚糖酶和IAA，DBS-5可产生嗜铁素、蛋白酶和纤维素酶活性。来自同一簇G10的菌株HWY-3-1、HWS-4-3、HNR-3-7、HS-4-7、DHWP-1，赋值分别为7、10、13、10、6，防效依次为100%、77.84%、61.83%、82.88% 和79.37%，可产生嗜铁素和蛋白酶。在此基础上，从同一簇菌株中优选还具有颉颃活性的HWY-3-1测定田间防效，表现稳定防效。田间测试的5个菌株，3个菌株无平板颉颃活性，田间防效表现一般，但防效低于有颉颃活性的菌株HWY-3-1和 HNR-3-7。在温室防效测试中，还具有颉颃活性菌株HWY-3-1（100%）和HWS-4-3（77.84%），其防效和无颉颃活性菌株防效HS-4-3（82.88%）和DBS-5（85.96%），差异不显著。由此可见，颉颃活性和酶活性在生防潜力菌株筛选中，同等重要。
　　芽孢杆菌和假单胞类细菌是生防细菌的最大家族，而前者更是防治真菌、细菌病害的优选对象。生防细菌发挥抗菌作用的机理主要包括产生抗生物质、产生胞外酶如几丁质酶、纤维素酶、蛋白酶和β-1，3-葡聚糖酶等来抑制病原物的生长、与病原物竞争营养如产生嗜铁素、与病原物竞争空间位点、诱导植物产生抗病性[25-28]。本研究从木薯多个生境分离到298株颉颃细菌，丰度较好，可分为21个簇；经过测序分析，芽孢杆菌所占比例较大，有Bacillus pumilus、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus cereus、Bacillus megaterium、Bacillus subtilis等。298个菌株产生水解酶活性比例不同，其中以产生蛋白酶活性的菌株比例最高，为53.69%；产生嗜铁素和生长素IAA的菌株比例分别高达68.12%和50.34%。对298个菌株的平板颉颃效能、产酶活性和代谢能力进行赋值，每个生境选择出至少1个菌株，从中筛选得分较高的88株细菌进行聚类分析和测序分析，挑选11个综合赋值评估较高效的菌株开展温室盆栽防效实验，发现其中赋值得分较高的菌株温室防效较高；优选5株不同种的细菌，测定其田间防效，平均防效均高于对照组，但低于温室盆栽防效。导致这种结果出现的重要原因之一可能是因为在田间使用菌剂过程中菌剂的生态环境远远复杂于理想的温室条件；但本研究的有效生防菌HWY-3-1仍表现出38.11%的平均防效，在CBB发病起初，该菌株防效达到74.20%；该菌株具有较好的平板颉颃效果以及产生嗜铁素和蛋白酶的活性，后期还发现该菌株可在木薯叶片较好定殖，能影响叶片的微生物群落结构多样性（Zheng et al，unpublished）。
　　也有相关研究表明，从根围土中分离的生防潜力菌株其防效可能更持久和稳定，郑丽等[29]在研究黄瓜霜霉病的生物防控中发现，筛选的PGPR菌来自健康或发病植株的根围土或者叶围，推测根围土和叶围可能是生防菌分离的优选。在本研究中，从不同生境分离生防潜力菌株，如健康或發病植株的根围土、根、茎、叶的内生菌和外生菌；酶活性、颉颃和防效数据表明，叶围（HWY-3-1）和根围土（HS-4-3）是生防菌分离较好的来源（表2～5）。产生蛋白酶活性比例最高的生境为根内（HNR，84.60%），几丁质酶的为茎内（DDNS，14.30%）、嗜铁素的为茎围（DHWS，92.90），纤维素酶的茎内（DHNS，62.50%），β-1，3-葡聚糖酶的为根围土（HS，42.90），IAA的为根围（DDWR，88.90%）；9株具有颉颃活性菌株分离的生境为叶围（HWY，14.3%）、茎围（HWS，8.8%）、根围（HWR，8.7%），土壤（DHWS，7.1%）、根内（HNR，7.7%）。可见，生防潜力细菌的多样性，也为获得优质生防菌提供了重要的基础。
　　目前，报道防治CBB的药剂有治农菌和中生菌素，防效分别为71.39%和64.32%；其次是高营链霉素和大生，校正防效分别为57.41%和52.83%；杀毒矾和春雷霉素的防效分别是35.77%和29.37%[18]，其中，陈奕鹏报道有内生生防菌株类芽孢杆菌属[30]，与研究中发现的生防细菌HWY-3-1（Bacillus pumilus）防效相似。其中DHNS-3-5（Curtobacterium citreum）、HS-4-3（Enterobacter sp.）、DBS-5（Microbacterium arborescens）也可作为后期联合混配生防菌剂的材料。
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