酵母DV10发酵低醇度椰子水研究

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　椰子水（Coconut water，CW）是存在于椰子果實腔内的一种天然果汁，富含糖类、氨基酸、维他命和矿物质等多种营养成分，口感清凉，具有解渴降暑、消肿利尿、调节体内电介质平衡等多种功效，深受消费者的喜爱[1-5]。然而，椰子加工主要以椰肉为原料，作为副产物的椰子水常被当作废弃物丢弃，不仅造成了大量的资源浪费，还严重污染了环境，据不完全统计，我国椰子加工业每年可产生副产物椰子水近8亿升，泰国每年高达20万吨的椰子水被浪费，全球范围内，每年产生的椰子水副产物高达250亿升[6-9]。且随着椰子肉需求量逐渐增大，尤其是椰子汁产业的快速发展，椰子水的浪费量也在逐年递增。
　　发酵动力学是研究发酵过程中微生物生长代谢与各环境因子之间的相互作用，并随时间变化规律的一门学科。微生物发酵是由多种物质参与的复杂代谢过程的综合作用结果，微生物反应的动力学方程必须由数学模拟得到。目前，经过微生物生理学家和生化工程学家的大量模拟试验和反复的验证修正，提出了许多数学模型。根据培养液中的细胞浓度在特定环境条件下的最大值，常用Logistic方程[10]描述菌体生长动力学；根据酵母的酒精生成与自身生长部分偶联型关系，常选择Luedeking-Piret方程[11]描述酒精生成动力学；根据底物消耗速率主要取决于细胞生长速率、酒精生成速率和底物维持能耗的速率，常选择Luedeking-Piret方程描述底物消耗动力学。
　　发酵饮料是近年来的研究热点，具有降低胆固醇、抑菌和抗癌等功效[12-15]，通过发酵的方式改善椰子水品质也是拓宽椰子水应用范围的一个途径。发酵过程中的动力学研究可以直观反映菌体生长、底物消耗和产物生成的动态变化过程，且酵母发酵的动力学研究方法成熟、体系完整。因此，本文选用发酵能力较强的酿酒酵母DV10对成熟的椰子水进行发酵，在发酵条件优化的基础上应用Logistic方程和Leudeking-Piret方程建立了低醇度椰子水发酵过程中菌体生长、底物消耗和产物生成动力学模型，旨在为优质低醇度椰子水饮料研究和开发提供理论依据。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料与仪器
　　1.1.1 活性干酵母 酿酒酵母DV10购自拉曼公司。使用前用5%蔗糖水在42 ℃活化30 min。
　1.1.2 椰子水 成熟椰子取自海南泰丰源公司。
　　1.1.3 试剂 葡萄糖，蒽酮，偏重亚硫酸氢钠均为分析纯。
　　1.1.4 仪器 紫外可见分光光度计（北京普析TU1810，中国），超高速离心机（赛默飞世尔 Fresco 17，美国），手持折光仪（爱拓 PAL-1，日本），pH计（梅特勒-托利多FE20，中国），酒精计（京都电子DA-130N，日本）。
　　1.2 方法
　　1.2.1 低醇度椰子水饮料发酵工艺流程 选取新鲜的椰子破壳后短时间内取出椰子水（测得其糖度为4.4 °Brix，pH值为5.53），用滤布和硅藻土分别过滤得到澄清的椰子水。用蔗糖调节糖度至约10 °Brix，在90 ℃水浴杀菌10 min，冷却后添加0.02%偏重亚硫酸氢钠，分别取2 L椰子水装入已灭菌的3个3 L的发酵罐中。按体积分数5%的接种量将活化的酵母接种到发酵液中。接种后置于25 ℃恒温培养箱中静止发酵，每隔24 h取样测定发酵液中的细胞干重、酒精度和总糖含量。
　　1.2.2 椰子水减重 采用干重法测定，具体方法为：取发酵液置入离心管，12 000 r/min离心10 min，移去上清液，用无菌水清洗，离心；重复3次；干燥，称重。
　　1.2.3 酒精度的测定 采用蒸馏法测定，即将发酵液蒸馏后用酒精计测定酒精度。
　　1.2.4 残糖量的测定 蒽酮比色法[16]。
　　1.3 数据分析方法
　　所有结果均使用SPSS 22.0数据分析软件进行方差分析，结果以平均值±标准差表示。应用Origin 8.0 Pro对菌体生长、酒精生成和底物消耗动力学模型方程进行非线性回归模拟和动力学模型参数的求解并绘图。
　　2 结果与分析
　　在微生物的培养或发酵过程中，底物的消耗和产物的生成受到微生物的生长状态及代谢途径的制约。底物经微生物发酵主要去向包括：一是用于维持细胞正常的生命活动，二是通过代谢途径最终转化为产物，三是用于细胞增值。因此，要进行发酵动力学模型研究，应对菌体细胞数量、代谢产物生成和底物消耗3个状态变量进行数学描述[17]。
　　2.1 椰子水发酵过程中物质的变化
　　椰子水发酵过程菌体量、酒精产量和残糖量随发酵时间的变化如图1所示。发酵1～3 d时间内，酵母DV10的菌体量和酒精产量迅速增加，底物被快速消耗，说明酵母DV10能进入增殖阶段迅速，发酵滞后期不明显，适应环境能力较强。发酵时间第4天之后，酒精产量和椰子水消耗量几乎保持不变，菌体增加不明显，残糖量下降速度变缓，发酵进入稳定期。经过10 d发酵，菌体量为3.1 g/L，酒精產量为5.2% vol，残糖量为1.69 g/L。
　　2.2 发酵动力学模型建立
　　2.2.1 菌种生长动力学 椰子水发酵过程中酵母生长曲线是典型的“S”形方程，因此可利用Logistic方程描述菌体生长的变化规律，该方程能够较好地反映发酵过程中由于细胞浓度增加对其自身生长繁殖所产生的抑制效应[18]。即
　　式（2）中，xt为酵母菌浓度，g/L；μm为酵母最大的比生长速，h-1；t为发酵时间，h；xm为最大的酵母菌浓度，g/L。
　　用Origin Pro 8.0对发酵过程中的菌体量和发酵时间拟合，可得菌体生长的动力学模型参数见表1。
　　将发酵时间t代入式（2）可得到酵母DV10菌种生长拟合方程：
　　xt=3.02/[1+exp（3.46-1.91t）] （3）
　　如图2所示，酵母DV10接种后稍有延迟，即进入快速增长阶段，第4天进入稳定期，至第10天发酵结束酵母菌体量基本维持不变。相关系数R2=0.994，说明拟合度好。
　　2.2.2 酒精生成动力学模型 酒精产量的实验结果见图1，根据产物生成速率与细胞生长速率之间的关系，酒精生成与菌体自身生长并非完全同步，而是有一定的滞后性，因此符合部分生长偶联型，选择Luedeking-Piret方程进行描述[19]。即
　　如图3所示，酵母DV10接种后即进入酒精产量快速增长的对数期阶段。进入稳定期后，酒精含量几乎保持不变并维持至发酵结束。实测值与拟合值各点较为接近，相关系数R2=0.997，说明拟合度好。
　　椰子水发酵过程中的酒精生成主要由菌种数量、底物含量以及体系中酒精的浓度决定。只有在底物充足且酵母达到一定数量之后，酒精的产量才能快速提高，但是当酒精浓度达到一定值后，酵母产酒精的活性则会受到抑制而使得发酵液中酒精的浓度稳定在一定范围内。
　　2.2.3 底物消耗动力学模型 发酵残糖量的实验结果如图1所示。在发酵过程中，碳源和能源主要用于：（a）形成细胞物质即酵母生长，（b）产生供细胞维持生命的能量即维持酵母代谢，（c）生成产物如酒精和一些副产物。因此，底物消耗速率主要取决于细胞生长速率、酒精生成速率和底物维持能耗的速率。底物消耗动力学模型的表达式根据Luedeking-Piret方程可以推导为：
　　如图4所示，酵母DV10接种后，残糖量开始下降，对数期几乎保持匀速快速下降状态，稳定期糖降解速度缓慢；实测值与拟合值各点均较为接近。酵母DV10相关系数R2为0.997，说明拟合较好。
　　糖是发酵过程中的主要碳源，被酵母菌所分泌的酶系不断分解、转化，发酵过程中不但产生酒精，而且还产生CO2、醇、醛、酯、酸等其他代谢物。糖源不断被消耗，这些代谢产物的浓度则不断增加，主发酵结束之后，残糖会被继续分解，进而得到干酒。
　　2.3 椰子水发酵速率
　　以时间t分别对3种酵母发酵过程中菌体生长拟合曲线Xt、酒精生成拟合曲线Pt和底物消耗拟合曲线St求一阶导数得到以下3个方程：
　　酵母DV10菌体生长速率方程：
dx/dt=5.76×exp（3.46-1.91t）/[1+exp（3.46-1.91t）]2
　　酵母DV10酒精生成速率方程：
　　dp/dt=10.466×exp（3.46-1.91t）/[1+exp（3.46-1.91t）]2
　　酵母DV10底物消耗速率方程：
　　ds/dt=-159.89×exp（3.46-1.91t）/[1+exp（3.46-1.91t）]2-0.051×exp（1.91t）/{1-0.093[1-exp（1.91t）]}
　　如图5-A所示，由酵母菌体生长速率曲线可知，接种后酵母数量开始增长，生长速率不断提高。第2天达到速率最高值，之后开始下降，第5天增速几乎接近于0，此时酵母数量最高。酒精生成速率曲线图如图5-B所示，初始阶段酒精生成速率不断增加，并在第2天达到最高值，之后开始下降，第5天酒精生成速率接近于0，此时酒精积累量最大。发酵降糖速率曲线如图5-C所示，发酵开始后，降糖速率一直增加，第2天出现最大速率值，之后开始下降。
　　2.4 模型验证
　　由表4可知，3个模型的理论值和实验值的误差大部分小于10%，3个模型理论值和实验值的误差的平均值分别为4.75%、4.36%、4.42%，说明模型拟合较好。
　　3 讨论
　　应用Logistic和Leudeking-Piret方程建立了包括菌体生长动力学模型、底物消耗动力学模型和产物生成动力学模型3个发酵动力学模型。拟合结果显示，酵母DV10的模拟预测值与实际实测值之间的拟合度较好（0.994、0.997、0.997），且3个模型的理论值和实验值的误差大部分小于10%，3个模型理论值和实验值的误差的平均值分别为4.75%、4.36%、4.42%，因此可以很好地预测发酵过程的动态变化。通过对发酵动力学拟合方程一阶求导，得到低醇度椰子水发酵过程中菌种增长速率、酒精生成速率和底物消耗速率，从而能更清晰地认识椰子水发酵过程。
　　本研究的动力学模型主要参考张良[17]的研究，且动力学模型拟合度与之相近，其建立的蓝莓酒发酵过程中菌体生长、酒精生成以及糖消耗的动力学模型的决定系数分别为R2=0.991、0.985、0.979。在本研究中发现发酵过程中酒体中的椰子水风味变淡而酒精风味过重，因此可以参考杨劲松等[20]的方法，用高度酒浸渍椰肉再兑发酵椰子水，可以较好地丰富发酵椰子水中风味。
　　本研究选择实验室用3 L发酵罐进行椰子水发酵动力学研究，与全自动发酵罐中的放大培养有些区别。全自动发酵罐中带有搅拌操作且容积更大，罐内菌体生长和代谢会有所改变，仍需进一步分析各种发酵参数之间的联系，以构建全自动发酵罐中发酵动力学模型，为今后发酵过程计算机控制和自动化操作创造条件。
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