稳定快速构建PLDMV侵染性克隆的新方法

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　番木瓜畸形花葉病毒（Papaya leaf distortion mosaic virus， PLDMV）属于马铃薯Y病毒科马铃薯Y病毒属病毒，是一种新的威胁番木瓜种植业的病毒病害，近年来发病率逐年递增，且存在向全球蔓延的趋势[1-2]。PLDMV是单分体正义（+）单链ssRNA线状病毒，病毒颗粒平均长约750～825 nm[3]。PLDMV基因组由约10 153个核苷酸组成（不含3′端poly A），5′端和3′端各有1个非编码区，包含1个大的开放阅读框（ORF）和1个小的ORF（pipo），大的ORF编码3 269个氨基酸的多聚蛋白，经多聚蛋白自身的蛋白酶水解加工产生10个成熟蛋白（P1、HC-Pro、P3、6K1、CI、6K2、NIa-VPg、NIa-Pro、NIb和CP）[1]。目前，有关PLDMV基因功能、致病机理、传播媒介、寄主范围等研究较少，从而使PLDMV的防治面临巨大困难。
近年来，随着高通量测序技术的发展，人类发现和鉴定新病毒病原的能力得到巨大提升。例如，2009～2015年，研究者们已相继从植物上新发现4种类病毒，49种RNA病毒和DNA病毒[4]。为此，需迫切开展新病毒的基因功能、病毒与宿主、病毒与传播媒介互作等相关研究工作，而病毒侵染性克隆作为上述病毒研究的必备工具，其构建逐渐发展为病毒研究实验室的标准实验技能，也成为限制病毒研究的关键因素[5]。虽然目前构建侵染性克隆的技术方法已取得较大进步，但其构建仍然耗时耗力，还没有一种通用的能适合所有病毒的方法，尤其是对基因组较大的病毒的克隆，而且病毒克隆在大肠杆菌（Escherichia coli， E. coli）中普遍存在的不稳定性问题[6-8]，导致侵染性克隆的构建面临巨大挑战和困难。为了提高病毒基因组序列克隆在E. coli中的稳定性，有采用低拷贝载体[9-10]、降低培养温度[11]、接种前进行体外连接[12]、插入内含子[6-7， 13-15]及酵母同源重组[14， 16-18]等方法和策略。目前，后2种方法可能是应用较多且最有效的方式。本研究室在之前利用In-Fusion法构建体外转录的PLDMV全长cDNA侵染性克隆时发生缺失、突变、重组等不稳定现象，通过插入内含子的方式获得其在E. coli中稳定的克隆[19]。但插入内含子的方法可能受病毒种类、插入位点、内含子种类及数量等的影响，从而使其应用受到限制。而酵母同源重组可能是目前大片段DNA体内拼接克隆最强大的分子克隆技术，Gibson等[20]报道了一步法可将25个重叠DNA大片段在酵母细胞中成功拼接获得完整的支原体基因组。由此可见，酵母重组方法完全可以满足病毒学研究的需要，但目前利用酵母同源重組系统构建病毒侵染性克隆的策略，都是将病毒全长基因组序列与酵母-大肠杆菌穿梭载体或者酵母-大肠杆菌-农杆菌穿梭载体经酵母同源重组后，再转化到大肠杆菌中进行复制、增殖，由于病毒序列可能对大肠杆菌细胞产生毒性作用，从而仍然会导致病毒克隆在E. coli中的极不稳定现象。因此，本研究为了解决病毒序列克隆在E. coli中不稳定性，通过对酵母同源重组系统方法进行改进和优化，避开E. coli，建立了不转化大肠杆菌（E. coli-Free）的酵母同源重组系统，并成功构建了适用于农杆菌注射接种的PLDMV全长cDNA侵染性克隆。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 病毒 番木瓜畸形花叶病毒海南分离物（PLDMV-DF）由本实验室分离保存，并完成其全长基因组序列测定（GenBank登录号：JX974555）[1]；PLDMV-DF的体外转录侵染性克隆pT7-PLDMV-In2本实验室已构建保存[19]。
　　1.1.2 试剂 普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、大肠杆菌质粒提取试剂盒、E. coli HST08 Premium化学感受态细胞购自TaKaRa公司；2×EasyTaq PCR SuperMix（+dye）、EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix、Trans5α化学感受态细胞、Trans10化学感受态细胞和Trans1-T1化学感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；Trizol、Stbl3化学感受态细胞购自Invitrogen公司；酵母质粒提取试剂盒Yeast Plasmid Mini Kit购自OMEGA公司；Phusion超保真DNA聚合酶购自NEB公司；其他生化试剂为国产分析纯。
　　1.1.3 载体及菌株 用于酵母同源重组系统的酵母-大肠杆菌穿梭载体Yeast-pBS70T、双元载体pBIN61、酵母菌株YPH501和农杆菌C58C1菌株均由法国Thierry Candresse实验室惠赠[18]。
　　1.2 方法
　　1.2.1 引物设计与合成 根据PLDMV-DF的全长基因组序列，参考Youssef等[18]文献中报道的酵母同源重组的方法，利用Vector NTI Advance 11软件设计本实验所需引物（表1）。引物合成和测序均由英潍捷基（上海）贸易有限公司完成。
　　1.2.2 酵母同源重组构建体内转录的PLDMV-DF侵染性克隆 为了验证在酵母同源重组系统中，PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆分别在酵母、大肠杆菌和农杆菌中的稳定性，本实验采取在第3 709 nt位点插入内含子intron 2和不插入内含子两种方式构建适用农杆菌接种的PLDMV-DF侵染性克隆p35S-FL和p35S-FL-In2（图1）。
　　（1）无内含子的PLDMV-DF侵染性克隆p35S-FL的构建。以本实验室构建PLDMV-DF体外转录侵染性克隆时获得的第4 998 nt位腺苷酸发生缺失突变的质粒pT7-PLDMV4[19]为模板，分别用引物对PLDPCR1F/PLD5020R和PLD4991F/FLPLD3进行PCR扩增病毒基因片段1F和1R；用引物对PLDPCR2F/PCR2R和PCR3F/PCR3R分别从质粒pBin61上PCR扩增载体片段2和3；用引物对PCR4F/PLDPCR4R从质粒Yeast-pBS70T上PCR扩增载体片段4，本研究中用于载体构建的PCR反应均使用Phusion超保真DNA聚合酶。PCR产物用0.8%普通琼脂糖凝胶进行电泳检测，并回收其目的片段。将5个具有25～32 bp重叠区的DNA片段1F、1R、2、3和4用醋酸锂法化学转化自制的酵母YPH501感受态细胞，在色氨酸缺陷型的SD平板上筛选。后续的克隆鉴定时，采取以下2种方法：
　　方法一（图2-A），主要是参照Youssef等[18]文献中报道的方法，基本操作流程是通过收集SD缺陷型平板上生长的所有酵母菌落，并提取混合菌落的酵母质粒，然后转化Trans5α、Trans10、Trans1-T1、Stbl3和E. coli HST08 Premium化学感受态细胞，比较其生长情况及在不同大肠杆菌中的稳定性，转化E. coli后进行PCR和测序鉴定，测序结果正确的克隆电击转化农杆菌C58C1感受态细胞并直接进行侵染性分析。
方法二（图2-B），是对Youssef等[18]文献中方法的改进和优化，总体流程是经酵母同源重组后，为了验证PLDMV-DF全长克隆在酵母中的稳定性，先菌液PCR、质粒PCR和测序鉴定出酵母的阳性单克隆，再用酵母质粒直接转化农杆菌感受态细胞，然后鉴定出阳性农杆菌克隆用于后续侵染性分析，关键是不转化E. coli这一步骤。首先，从转化的酵母平板上挑取单菌落培养后，用病毒5′端引物对pldmv550F/pldmv1700R进行菌液PCR检测，然后对检测出的阳性克隆提取酵母质粒，再用扩增病毒全长基因组的引物对pldmv1F/pldmv3R进行质粒PCR鉴定，并对酵母质粒进行测序分析。由于酵母质粒拷贝数低，需用约50～100 mL的酵母菌液抽提质粒，然后将质粒用乙醇沉淀浓缩后送公司测序（测通）。测序正确的克隆，直接用浓缩后的酵母质粒电击转化农杆菌C58C1感受态细胞，转化后在含利福平、卡那霉素和庆大霉素的LB平板上进行筛选。从转化农杆菌的平板上挑取单菌落进行PCR和测序鉴定，农杆菌菌液PCR和质粒PCR鉴定方法同前面酵母克隆的鉴定，农杆菌质粒的提取使用大肠杆菌质粒提取试剂盒。为了验证病毒序列在农杆菌中的稳定性，对质粒PCR鉴定正确的克隆进行测序分析。由于农杆菌中质粒的拷贝数很低，需大量抽提农杆菌质粒后用乙醇浓缩沉淀，然后进行测序分析。测序正确的克隆即可进行下一步接种侵染性分析实验。
　　（2）插入内含子intron 2的PLDMV-DF侵染性克隆p35S-FL-In2的构建。以已构建含内含子intron 2的体外转录PLDMV-DF侵染性克隆pT7-PLDMV-In2[19]为模板，用引物对PLDPCR1F/FLPLD3扩增含intron 2的PLDMV-DF全长基因组片段1。将片段1和前面构建克隆p35S-FL时获得的3个载体片段（2、3和4）共同转化酵母YPH501感受态细胞进行酵母重组（方法同前）。后续的克隆鉴定时，也采用2种方法：为了验证插入内含子是否在E. coli中稳定，第1种方法采用与前面方法一相同（图2-A），但仅转化E. coli HST08 Premium感受态细胞；第2种方法是对前面方法二的优化（图2-C），根据前面实验结果，PLDMV-DF全长cDNA克隆在酵母、农杆菌中较稳定，为了省去繁琐的酵母、农杆菌克隆鉴定过程，利用酵母混合质粒直接转化农杆菌，农杆菌克隆经菌液PCR、质粒PCR或测序鉴定正确后即可用于后续接种实验。使用内含子intron 2插入位点两端的引物pldmv3600F/pldmv4444R进行菌液PCR检测；质粒PCR鉴定同上；对农杆菌质粒用引物对PLDPCR1F/PLD5020R和PLD4991F/FLPLD3将病毒全长基因组分成2个大片段PCR扩增，然后进行PCR产物测序，测序正确的克隆用于接种番木瓜。
　　1.2.3 PLDMV-DF侵染性克隆p35S-FL和p35S-FL-In2的侵染性分析 农杆菌注射接种的方法主要参考Youssef等[18]文献中报道的方法，接种生长至20～30 cm番木瓜的第3、4片叶（叶片长约1 cm为第1片叶）的下表皮。接种后的番木瓜苗置于25 ℃黑暗8 h和28 ℃光照16 h的温室条件下生长，每周观察其病症发生情况，在接种第20、40、60天，用数码相机拍照。用PLDMV-DF感染的番木瓜病叶摩擦接种健康番木瓜植株作为阳性对照组，阴性对照组为注射接种含空载体pBIN61的农杆菌，每个处理组至少接种10～12株番木瓜植株，进行3次重复实验。
　　注射接种实验的第60天，取新长出的第2片或第3片叶约50 mg，用TRizol法提取植物总RNA，用EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix试剂盒反转录合成cDNA第一链，进行RT-PCR检测。每株苗用引物对pldmv550F/pldmv1700R、pldmv3600F/pldmv4444R分别对PLDMV基因组的5′端P1基因和部分P3及部分CI基因序列进行RT-PCR检测，引物对pldmv3600F/pldmv4444R用于检测PLDMV基因组的第3 709 nt位点是否还含有插入的内含子intron 2序列，并对部分样品的RT-PCR扩增产物送公司进行序列测定分析。
　　2 结果与分析
　　2.1 无内含子的PLDMV-DF侵染性克隆p35S-FL的构建
　　PCR扩增获得用于酵母同源重组的2个病毒基因组片段1F、1R和3个载体片段2、3、4（图3-B），以上5个DNA片段经酵母同源重组后（图3-A）。当采取方法一时（图2-A），混合酵母质粒分别转化Trans5α、Trans10、Trans1-T1、Stbl3和E. coli HST08 Premium化学感受态细胞，各平板的生长情况与笔者之前构建其体外转录侵染性克隆类似。各转化平板菌落生长较慢，30 °C条件下需要培养24～48 h才可见菌落长出，菌落数达40～100个。经菌液PCR发现，插入到载体上的PLDMV-DF全长基因组序列均发生不同程度的DNA片段缺失、重组、突变等不稳定现象（结果未提供）。结果从转化Trans5α、Trans10、Trans1-T1、Stbl3这4种感受态细胞的平板上未鉴定出含有PLDMV-DF全长cDNA插入片段的克隆，而从转化E. coli HST08 Premium感受态细胞的平板挑取40个克隆，菌液PCR鉴定出10个克隆含有PLDMV-DF全长基因组插入片段，但随机挑选其中5个克隆进行测序分析，发现病毒PLDMV-DF全長基因组序列均发生点突变或碱基缺失突变（结果未提供）。结果表明，参照Youssef等[18]文献中报道的方法，酵母重组后转化E. coli很难获得正确的PLDMV-DF全长cDNA克隆。同时也表明，E. coli HST08 Premium感受态细胞可能比其他4种感受态更适合较长的病毒基因序列的克隆。由于获得的克隆均有突变，故没有进一步将这些质粒转化农杆菌用于后续侵染性分析实验。
　以上实验结果和以前构建PLDMV-DF体外转录侵染性克隆pT7-PLDMV[19]的结果均表明，这种不稳定现象可能发生在E. coli中，因此，笔者尝试避免转化E. coli，酵母同源重组后直接转化农杆菌。同时为了探究PLDMV-DF全长基因组序列在酵母和农杆菌中的稳定性，从而分别对酵母重组和农杆菌转化后的质粒进行序列测定。本实验通过对酵母同源重组系统进行改进和优化，当采用改进后的方法二时（图2-B），对转化的酵母平板进行单克隆鉴定，54个单克隆经菌液PCR初步鉴定出3个克隆可能为阳性克隆（结果未提供），经质粒PCR和质粒测序鉴定，这3个克隆的测序结果完全正确（结果未提供）。結果表明PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆在酵母细胞中相对稳定，不稳定现象主要发生在E. coli细胞中。挑选其中1个测序正确克隆的酵母质粒直接转化农杆菌C58C1，获得42个克隆，经初步菌液PCR鉴定出3个克隆可能为阳性克隆（结果未提供），其中1个克隆摇菌失败，另外2个克隆提取质粒后PCR鉴定和测序均正确（结果未提供），即利用改良的酵母同源重组系统成功构建了无内含子的PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆p35S-FL，并将这2个克隆用于后续侵染性分析且分别命名为：p35S-FL39-12和p35S-FL39-34。
　　2.2 插入内含子intron 2的PLDMV-DF侵染性克隆p35S-FL-In2的构建
　　从pT7-FL-In2质粒上经PCR扩增获得在第3 709 nt位点插入内含子intron 2的PLDMV-DF全长基因组片段1（图4-B），片段1与前面已获得的片段2、3、4转化酵母YPH501进行酵母同源重组（图4-A），获得较多的酵母菌落（超过100个克隆），收集所有菌落提取酵母混合质粒。
　　当采用第1种方法时，酵母混合质粒转化E.coli HST08 Premium长出多达100～200个克隆，随机挑取22个克隆经菌液PCR鉴定均可能为阳性克隆（表2），对其中1个克隆测序，结果正确（结果未提供）。测序正确的克隆转化农杆菌后随机挑取28个克隆经菌液PCR鉴定出27个克隆可能为阳性克隆（表2），对其中1个克隆提取质粒后进行质粒PCR和测序鉴定均正确（表2）。
　　当采用第2种方法时，利用酵母混合质粒直接转化农杆菌随机挑取24个克隆经菌液PCR鉴定出22个克隆可能为阳性克隆（表2），对其中1个克隆提取质粒后进行质粒PCR和测序鉴定，结果均正确（表2）。即利用原酵母同源重组系统和改良后的系统都成功构建了适用于农杆菌接种的含有内含子intron 2的PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆p35S-FL-In2，并将以上2种方法构建获得的测序正确的2个克隆用于后续侵染性分析且分别命名为：p35S-FL-In22-1和p35S-FL-In22-3。
　　2.3 体内转录的PLDMV-DF侵染性克隆注射接种番木瓜的病症表现
　　体内转录的PLDMV-DF侵染性克隆p35S-FL（农杆菌克隆p35S-FL39-12和p35S-FL39-34）和含内含子intron 2的PLDMV-DF侵染性克隆p35S-FL-In2（农杆菌克隆p35S-FL-In22-1和p35S-FL-In22-3）农杆菌注射接种番木瓜的结果表明：克隆p35S-FL39-12、p35S-FL39-34、p35S-FL-In22-1和p35S-FL-In22-3接种番木瓜植株的症状表现与用PLDMV-DF感染的番木瓜病叶接种的阳性对照组一致，在接种20 d后，叶片出现轻微的花叶，叶脉开始褪绿及黄化，以及叶片产生黄绿相间的嵌纹斑（图5-A）。在接种40 d后，叶片逐渐出现皱缩畸形，叶片上有绿岛（green-island）形成（图5-B）。在接种60 d后，随着症状的严重，会出现完全畸形叶、鸡爪形，有时会出现叶片完全退化，仅剩下主叶脉的丝状叶（图5-C）。而接种转化空载体pBIN61的农杆菌阴性对照组在接种60 d后仍未表现出任何病症（图5-A、C）。
　　2.4 体内转录的PLDMV-DF侵染性克隆注射接种番木瓜后的RT-PCR检测及侵染效率分析
　　接种60 d后，对接种过的番木瓜植株分别用PLDMV-DF基因组2个基因片段引物进行RT-PCR检测，4个侵染性克隆p35S-FL39-12、p35S-FL39-34、p35S-FL-In22-1、p35S-FL-In22-3与用番木瓜病叶接种的阳性对照组都能检测出1 151 bp和845 bp的DNA条带（图6，泳道1～18），而转化空载体pBIN61的农杆菌注射接种的阴性对照组未检测到（图6，泳道19～20），表明注射接种含空载体的农杆菌不能侵染番木瓜植株。而同时RT-PCR产物测序结果显示，均为PLDMV-DF病毒基因组序列，而且在第3 709 nt位点无内含子intron 2插入，表明克隆p35S-FL-In22-1和p35S-FL-In22-3在侵染后，利用番木瓜宿主系统可以识别并剪接插入在PLDMV-DF基因组第3 709 nt位点的内含子intron 2，使子代病毒不再含有内含子序列。经病症观察、发病情况统计及RT-PCR检测，结果表明，本实验中利用改良的酵母重组系统构建的4个适用农杆菌注射接种的体内转录侵染性克隆p35S-FL39-12、p35S-FL39-34、p35S-FL-In22-1、p35S-FL-In22-3都具有侵染性，能成功侵染番木瓜，侵染效率达64.7%～69.7%，且病症观察的发病率与RT-PCR检测结果一致（表3）。
　　3 讨论
　　病毒侵染性克隆是研究病毒基因功能和病毒与宿主互作的重要工具，无论是研究植物病毒还是动物病毒，无论是DNA病毒还是RNA病毒，其侵染性克隆的构建已发展为病毒研究实验室的标准实验技能，也成为开展病毒深入研究工作的限制因素[5]，而病毒全长基因组克隆在E. coli中存在的不稳定性问题是病毒侵染性克隆构建面临的最大困难和挑战[6-8]。为了克服病毒基因序列在E. coli中的不稳定性，在侵染性克隆构建时通常采用低拷贝载体[9-10]、降低培养温度[11]、接种前进行体外连接[12]、插入内含子[6-7， 13-15]及酵母同源重组[14， 16-18]等方式，但还没有一种能适合所有病毒的通用方法。笔者也通过在P3基因插入内含子，利用In-Fusion法成功构建了体外转录的PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆[19]，但插入内含子的方法可能受病毒种类、插入位点、内含子种类及数量等的影响，从而使其应用受到限制[19]。而且体外转录的侵染性克隆需要昂贵的体外转录试剂，不便于后续研究应用。于是，本研究尝试利用酵母同源重组系统快速构建适用于农杆菌注射接种的体内转录的PLDMV-DF侵染性克隆。但研究发现，采用原酵母同源重组系统在酵母细胞中完成重组拼接后，再转化E. coli细胞仍然存在不稳定现象，并不能获得正确的克隆。而在PLDMV-DF的P3基因插入内含子时，经酵母重组后转化E. coli能获得测序正确的克隆，而且酵母重组后的克隆和转化农杆菌后的克隆测序结果表明，不稳定现象仅发生在E. coli中，而非酵母细胞和农杆菌细胞。但Youssef等[18]利用原酵母同源重组系统也成功获得适用农杆菌接种的苹果褪绿叶斑病毒（Apple chlorotic leaf spot virus， ACLSV）的体内转录侵染性克隆，可能不同的病毒在E. coli中的稳定性存在着差异，不过从36个经限制性内切酶酶切正确的E. coli克隆中仅鉴定出1个有侵染性的克隆，表明ACLSV克隆在E. coli细胞同样存在着不稳定性。因此，本研究为了克服病毒基因组序列克隆在E. coli中的不稳定性，通过对原酵母同源重组系统进行改良，采用避免转化E. coli细胞的策略，将酵母同源重组获得的混合酵母质粒直接转化农杆菌（图2-C），10 d内即可快速、便捷的构建稳定的适用于农杆菌注射接种的PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆。同时，该构建策略为其他在E. coli细胞中不稳定的植物病毒侵染性克隆的构建提供了一种有效的新方法。